脂肪酸結合蛋白評價大鼠缺血性心肌損傷的價值

余雷李醇文黃明鉅1寧宗2

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院急救部，重慶400000)

摘要〔〕目的探討脂肪酸結合蛋白(H-FABP)在異丙腎上腺素誘導的心肌缺血中對評價心肌損傷中的價值。方法將128只大鼠隨機分成4組，采用異丙腎上腺素建立不同程度的心肌缺血模型，分為正常對照組和低、中、高劑量實驗組，取4個時間點，用Western印跡法檢測不同程度心肌缺血大鼠血清中H-FABP表達水平，分析心肌缺血后血清H-FABP含量與時間關系，分析大鼠心肌缺血嚴重程度與血清H-FABP含量之間關系。結果①心肌缺血大鼠模型建立成功，大鼠心肌缺血后血清中H-FABP含量2 h已有升高，4 h明顯增高，與正常對照組差異顯著(P<0.05)，16 h已有下降，32 h基本降至正常。②大鼠血清H-FABP升高的倍數(shù)隨其心肌缺血程度加重而遞增(P<0.05)。結論H-FABP在心肌缺血發(fā)生的早期即有明顯升高，持續(xù)時間較短，H-FABP可作為缺血心肌損傷早期診斷的心肌標志物和評價損傷程度指標。

關鍵詞〔〕心肌缺血；脂肪酸結合蛋白；蛋白免疫印跡

中圖分類號〔〕R466〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：廣西教育廳科研資助項目(No.201012MS063)

通訊作者：寧宗(1968-)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導師， 主要從事急診危重癥、急性中毒救治研究。

1重慶市三峽中心醫(yī)院2廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院急診科

第一作者：余雷(1982-)，男，碩士，住院醫(yī)師，主要從事急診危重癥研究。

心肌缺血性損傷，特別是急性心肌梗死(AMI)是嚴重威脅人類生命健康的主要疾病之一，對AMI的早期診斷及缺血導致心肌損傷程度的評價尤為重要，目前診斷AMI的重要指標有肌酸激酶(CK),肌酸激酶同工酶(CK-MB)等，對其測定存在早期診斷靈敏度不高，損傷程度評價特異性差等不足。心肌脂肪酸結合蛋白(H-FABP)是一種高度特異性的主要分布在心肌細胞內的低分子量可溶性蛋白，在心肌細胞受損時能快速從心肌細胞釋放進入血液〔1,2〕，在心肌梗死后患者血液中出現(xiàn)早，且特異性較高〔3〕。本研究采用鹽酸異丙腎上腺素構建大鼠心肌缺血模型，通過檢測心肌缺血后的大鼠血清中H-FABP的表達，探討H-FABP含量變化與心肌缺血后時間關系，評價與心肌缺血程度的關系。

1材料與方法

1.1 動物及分組健康Wistar大鼠128只，雌雄不限，體重140～150 g，由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，隨機分為正常對照組(腹腔注射生理鹽水20 mg/kg)，低、中、高劑量實驗組(腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素10、20、40 mg/kg)，每組32只，隨機分配。

1.2 主要試劑與儀器鹽酸異丙腎上腺素購于上海禾豐有限公司，血液總蛋白提取試劑盒購于北京白泰克生物技術有限公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo公司，H-FABP和GAPDH羊抗鼠一抗購自Santa Cruz Biotechnology,Inc，PVDF膜購自北京索萊寶科技有限公司，紅外熒光染料標記的驢抗羊二抗購自美國LI-COR公司，成像系統(tǒng)為統(tǒng)美國LI-COR公司的Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)，圖像分析軟件為LI-COR公司開發(fā)的Odyssey。

1.3 方法

1.3.1 心肌缺血大鼠模型的建立按照10、20、40 mg/kg計算，準備藥物，每組每只大鼠所需注射鹽酸異丙腎上腺素的量，分別為1、2、4 ml，正常對照組即注射生理鹽水2 ml。注射后2 h做心電圖觀察。在用藥后第2、4、16、32小時4個時間點在每組中分別隨機取出8只大鼠，挖眼球取血4 ml左右，置于無菌離心管中，用血液總蛋白提取試劑盒提取總蛋白。

1.3.2 Western印跡法檢測H-FABP表達將提取的大鼠血清總蛋白用BAC法測定蛋白濃度，體積按4∶1加5×上樣緩沖液混勻，根據(jù)測算的濃度確定30 μg為上樣量，換算出各自的實際上樣體積，用普通PCR儀煮沸5 min變性，進行SDS-PAGE電泳分離蛋白(5%濃縮膠，12%中間膠，15%分離膠)，濃縮膠跑40 V的恒壓，分離膠跑80 V的恒壓，按照蛋白質Marker切下H-FABP和GAPDH膠段，轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉非特異抗原2 h，PBS-T洗滌1次，5 min，分別加入1∶800稀釋的H-FABP羊抗鼠多克隆抗體和1∶1 000稀釋的羊抗鼠GAPDH多克隆抗體，室溫1 h，4℃過夜。PBS-T洗滌4次，每次5 min。在分別加入1∶10 000稀釋的紅外熒光染料標記的驢抗羊二抗，室溫震搖2 h，PBS-T洗滌3次，每次5 min，PBS洗滌1次,10 min。美國LI-COR公司的Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描，采用Odyssey分析軟件進行條帶灰度值的分析。每個樣本條帶與相對應樣本GAPDH條帶的灰度值相比，求出其比值即為H-FABP的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0軟件進行方差分析。

2結果

2.1 大鼠心肌缺血模型構建成功與正常對照組大鼠比較，各實驗組注射鹽酸異丙腎上腺素后其心電圖出現(xiàn)典型的心肌缺血性改變(ST段抬高，T波倒置，病理性Q波)，劑量越大心肌缺血越嚴重，表明大鼠心肌缺血模型構建成功。見圖1。

2.2 Western印跡法檢測不同時間點大鼠血清H-FABP表達如圖2、表1所示，實驗組大鼠血清H-FABP含量在注射鹽酸異丙腎上腺素后2 h已有升高，4 h更高，藥物劑量增大血清H-FABP含量增高(P<0.05)，在心肌缺血后16 h已有下降，32 h

圖1　各組大鼠心電圖變化

1～4：正常對照組、低、中、高劑量實驗組 圖2　 Western印跡檢測各組不同時間點 大鼠血清H-FABP表達

組別2ph16p2h正常對照組0.69±0.320.71±0.240.74±0.260.59±0.23低劑量實驗組2.03±0.941)3.29±1.151)2)3)2.54±1.261)0.63±0.253)中劑量實驗組3.36±1.221)4.37±1.361)2)3)2.73±1.151)1.12±0.463)高劑量實驗組4.30±1.841)2)6.58±2.461)2)3)4.21±1.961)2)1.34±0.441)3)

與同時間點正常對照組比較：1)P<0.05，與同時間點其他實驗組比較：2)P<0.05，與同劑量組不同時間點比較：3)P<0.05

基本降至正常(P<0.05)，心肌缺血程度越嚴重，H-FABP含量越高(P<0.05)。

3討論

H-FABP是一種小分子量(約15 000)的胞質蛋白，富含于心肌細胞內，具有心肌特異性，與心肌細胞內的長鏈脂肪酸相結合，將其從細胞質膜向脂化和氧化部位運輸，從而進入能量代謝體系氧化分解，最終生成三磷酸腺苷，為心肌收縮提供能量〔4〕，由于心肌細胞對缺血缺氧高度敏感〔5,6〕，當心肌缺血時，需要動員脂肪酸供能，導致心肌細胞內H-FABP迅速升高，又由于其分子量小，可快速釋放入血，其血漿濃度在心肌細胞因缺血受損后 1.5～3 h開始升高，6～8 h達峰〔1,2〕。本研究結果與上述結果一致，提示血清H-FABP濃度可用于心肌缺血早期診斷。McCann等〔7〕在664 例因胸痛入院患者的研究發(fā)現(xiàn)，患者在胸痛癥狀出現(xiàn)4 h內檢測，其H-FABP診斷急性心肌梗死的敏感性要遠遠高于肌鈣蛋白T(cTnT)(73%比55%，P=0.043)，其特異性為71%，而其他心肌標志物診斷急性心肌梗死的敏感性和特異性都未超過cTnT。Glatz等〔8〕通過研究也曾推薦H-FABP可作為急性心肌梗死早期診斷的心肌標志物。本次研究還發(fā)現(xiàn)，在大鼠心肌缺血后16 h已有下降，在32 h基本降至正常，此發(fā)現(xiàn)與Chan等〔9〕研究結果一致，他們通過代謝動力學研究顯示H-FABP血漿濃度于梗死后早期快速升高并達到頂峰，但血漿濃度恢復正常的時間也相對早，只需要30 h，具有較高的敏感性。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著鹽酸異丙腎上腺素劑量的增大，大鼠心肌細胞缺血越嚴重，通過Western印跡法檢測大鼠血清中H-FABP的含量亦是越高的，心肌缺血嚴重性增加，心肌梗死的面積相應擴大，表明H-FABP高低與心肌梗死面積大小是正相關的。臨床上AMI 后心肌梗死面積的評估對于預后判斷有著重要價值，梗死面積常通過一些間接方法估算，如心臟超聲(射血分數(shù)，室壁運動異常)、心肌核素灌注顯像、心電圖的改變(累及的導聯(lián)數(shù))、 CK-MB峰值等。H-FABP在胸痛發(fā)作后迅速釋放入血并在較短時間內清除，若按足夠的頻度采集標本，可用于早期測定AMI 的梗死面積。Glatz等〔10〕和 Sohmiya等〔11〕的研究證實，應用血漿H-FABP測定梗死面積與CK-MB、α-羥丁酸脫氫酶(α-HBDH)測定梗死面積的相關性非常好，H- FABP的優(yōu)點在于比CK-MB、α-HBDH能更早地測定梗死面積，它們各自需要的時間是24、48、72 h。 另外，心力衰竭時由于心肌細胞相對缺血、缺氧，其結構和功能都會發(fā)生改變，造成心肌損傷，而且心力衰竭越嚴重，這種損傷越明顯，加重心肌缺血，Komamura等〔12〕曾對92 例擴張型心肌病患者進行4年隨訪，觀察患者血漿H-FABP的濃度變化，結果發(fā)現(xiàn)血漿H-FABP濃度≥5．4 ng/ml的患者與低于此濃度的患者相比，生存率明顯降低(P<0．000 1)。

總之，H-FABP作為靈敏的心肌缺血生化指標，在AMI早期診斷，評估梗死面積等方面均有重要臨床價值，但由于存在時間窗，H-FABP檢測若能與CK、CK-MB、cTnI等標志物結合應用，臨床意義更大。

4參考文獻

1Glatz JF，Luiken JJ，Nieuwenhoven FA，etal．Molecular mechanism of cellular uptake and intracellular translocation of fatty acid〔J〕.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，1997;57(1):3-9．

2Glatz JF，van der Voort D，Hermens WT，etal．Fatty acid-binding protein as the earliest available plasma marker of acute myocardial injury〔J〕．J Clin Ligand Assay，2002;25(2):167-77.

3Azzazy HM，Pelsers MM，Christenson RH． Unbound free fatty acids and heart-type fatty acid-binding protein:diagnostic assays and clinical applications〔J〕．Clin Chem，2006;52(1):19-29.

4Luiken JJ，Coort SL，Koonen DP，etal．Regulation of cardiac long-chain fatty acid and glucose uptake bytranslocation of substrate transporters〔J〕．Pflugers Arch，2004;448(1):1-15．

5王艷麗，孫智睿，杜麗娟，等．缺氧后適應中蛋白激酶 C與鈣敏蛋白受體相互作用對乳鼠心肌細胞的保護作用〔J〕．中國病理生理雜志，2009;25(8):1457-62．

6曾翔俊，王紅霞，王艷霞，等．硫化氫拮抗乳鼠心肌缺氧/復氧損傷機制初探〔J〕．中國病理生理雜志，2009;25(5):839-43．

7McCann CJ，Glover BM，Menown IB．Novel biomarkers in early diagnosis of acute myocardial infarction compare with cardiac troponin T〔J〕．Eur Heart J，2008;29(23):2843-50.

8Glatz JF，Van der Vusse GJ，Simoons ML，etal．Fatty acid-binding protein and the early detection of acute myocardial infarction〔J〕．Clin Chim Acta，1998;272(1):87-92.

9Chan CPY，Sanderson JE，Ganz JFC，etal．A super early myocardial infarction marker-human heart type fatty acid binding protein〔J〕．Z Kardiol，2004;93(5):388-97.

10Glatz JF，Kleine AH，van Niewenhoven FA，etal．Fatty acid-binding proteinas a plasma marker for the estimation of myocardial infarction size in humans〔J〕． Br Heart J，1994;71:135-40.

11Sohmiya K，Tanaka T，Tsuji R，etal．Plasma and urinary heart-type cytoplas-mic fatty acid-binding protein in coronary occlusion and reperfusion induced myocardial injury model〔J〕.J Mol Cell Cardiol，1993;25(12):1413-26．

12Komamura K，Sasaki T，Hanatani A，etal．Heart-type fatty acid binding pro-tein is a novel prognostic marker in patients with non-ischemic dilated cardio-myopathy〔J〕.Heart，2006;92(5):615-8.

〔2014-03-21修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)