siRNA干擾缺氧誘導(dǎo)因子2α對乳腺癌細胞侵襲能力的影響及相關(guān)機制

李娜王洪興張潔李永真千新來

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003)

摘要〔〕目的探討缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-2α siRNA對乳腺癌細胞MCF-7侵襲能力的影響及相關(guān)機制。 方法采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)沉默已建立的缺氧細胞模型MCF-7細胞中HIF-2α的表達；RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染后MCF-7細胞中HIF-2α mRNA的表達；采用劃痕實驗和侵襲實驗探討細胞侵襲能力的變化；采用Western印跡和RT-PCR方法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2的表達。結(jié)果RNAi結(jié)果顯示，缺氧+siRNA組HIF-2α mRNA的表達與單純?nèi)毖踅M相比均明顯降低(P<0.05)；轉(zhuǎn)染后劃痕實驗結(jié)果顯示，缺氧+siRNA組與單純?nèi)毖踅M相比細胞傷口愈合速度明顯減慢。Transwell侵襲實驗顯示，缺氧+siRNA組與單純?nèi)毖踅M相比穿膜細胞數(shù)顯著減少(P<0.05)；Western印跡和RT-PCR結(jié)果顯示，缺氧+siRNA組與單純?nèi)毖踅M相比，MMP-2蛋白及mRNA表達均下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論HIF-2α siRNA抑制乳腺癌MCF-7細胞侵襲能力的機制之一可能與MMP-2基因的表達下調(diào)有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕缺氧誘導(dǎo)因子2α；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；RNA干擾；乳腺癌；侵襲

中圖分類號〔〕R73-37〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：河南省科技廳科技攻關(guān)資助項目(112102310206)；河南省教育廳自然科學(xué)資助項目(2011A310005)；河南省高校青年骨干教師資助項目(2012GGJS-136)

第一作者：李娜(1977-)，女，博士，副教授，主要從事惡性腫瘤分子病理學(xué)研究。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最顯著的生物學(xué)特性，是惡性腫瘤頑固性、難治性和患者死亡的根本原因。有研究顯示約90%的惡性腫瘤患者死于轉(zhuǎn)移。目前，對于惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的復(fù)雜機制仍不十分清楚。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)是低氧微環(huán)境中對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起關(guān)鍵性作用的主要調(diào)節(jié)因子。近年來國內(nèi)外學(xué)者的研究多集中于HIF-2α與腫瘤發(fā)生的關(guān)系，而關(guān)于HIF-2α與乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系，目前國內(nèi)外研究較少〔1,2〕。本研究以乳腺癌細胞MCF-7缺氧模型為研究對象，采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，探討HIF-2α siRNA對乳腺癌細胞MCF-7侵襲能力的影響及相關(guān)機制。

1材料與方法

1.1 材料SuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR 試劑盒、lipofectamineTM2000均為Invitrogen公司產(chǎn)品。HIF-2α siRNA(2對)由廣州市銳博生物科技有限公司合成，引物由上海生物工程公司合成。人低轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞系MCF-7購于中科院上海細胞庫。

1.2 細胞培養(yǎng)與基因轉(zhuǎn)染建立好的缺氧模型乳腺癌細胞在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的完全培養(yǎng)基中37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細胞長至80%融合時，按Invitrogen公司lipofectamineTM2000說明書進行轉(zhuǎn)染，設(shè)置親本對照組、單純?nèi)毖踅M(加100 μmol/L CoCl2)、缺氧+siRNA 1組(序列：gcaaauguacccaaugauadTdT)、缺氧+siRNA 2組(序列：cagcaucuuugauagcagudTdT)、缺氧+無義siRNA組(序列：cagcaggguugauagcaugdTdT)、缺氧+轉(zhuǎn)染試劑組，轉(zhuǎn)染9 h后，更換新鮮完全培養(yǎng)基。

1.3 RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞中HIF-2α mRNA的表達RNA提取過程按照Trizol RNA提取試劑盒說明書進行，體外逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈，以cDNA為模板，通過PCR方法擴增HIF-2α mRNA。引物序列上游：5′-tgaaaacgagtccgaagcc-3′，下游：5′-gtggctgacttgaggttga-3′；GAPDH上游：5′-attcatctctcctctccca-3′，下游：5′-gttggtggttggtactgt-3′，預(yù)期擴增片段大小分別為342 bp和580 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃×2 min，94℃×1 min、55℃×1 min和72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。取5 μl用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上成像及測定分析。

1.4 劃痕實驗常規(guī)消化對數(shù)生長期的MCF-7親本對照組細胞、單純?nèi)毖踅M細胞、缺氧+HIF-2α siRNA1組細胞、缺氧+HIF-2α siRNA2組細胞，計數(shù)后接種24孔板，37℃，5% CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，共5組，各組均設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)至80%匯合態(tài)時，在單層細胞上劃一個“十”字，24 h更換新正常培養(yǎng)基，分別在0、6、12、24、48 h時間段觀察并照相。

1.5 細胞體外侵襲力測定加含10%FBS的完全培養(yǎng)基于24孔板(600 μl/孔)，取出小室放入24孔板中，膜上鋪人工基底膜Matrigal膠。取單細胞懸液400 μl接種入小室，常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出小室，結(jié)晶紫染色。通過倒置顯微鏡下機計數(shù)6個視野穿膜細胞數(shù)，每組設(shè)3個平行樣本，共重復(fù)三次計算平均值。侵襲指數(shù)=實驗組穿膜細胞數(shù)/對照組穿膜細胞數(shù)×100%；細胞侵襲力抑制率=(對照組穿膜細胞數(shù)-實驗組穿膜細胞數(shù))/對照組穿膜細胞數(shù)×100%。

1.6 Western印跡檢測各組細胞中MMP-2蛋白的表達按照試劑盒說明書提取各組細胞質(zhì)、細胞核蛋白，蛋白上清經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用含1%脫脂奶粉的TBST (Buffered Saline Tween-20)封閉30 min，加Ⅰ抗4℃孵育過夜，TBST洗滌；辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗室溫孵育2 h，TBST洗滌，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育5 min，經(jīng)X線片曝光、顯影、定影。顯色結(jié)果用軟件Total Lab2.0進行灰度分析，并計算蛋白的相對表達水平。

1.7 MMP-2 mRNA表達RT-PCR方法檢測各組細胞中MMP-2 mRNA的表達。

2結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染24 h后各組細胞中HIF-2α mRNA的表達HIF-2α mRNA的相對表達量在缺氧+siRNA1組(0.411±0.018)和缺氧+siRNA2組(0.385±0.001)分別與單純?nèi)毖踅M(0.737±0.007)、缺氧+無義siRNA組(0.652±0.009)和缺氧+轉(zhuǎn)染試劑組相比顯著降低(0.683±0.004,P<0.05)。缺氧+無義siRNA組和缺氧+轉(zhuǎn)染試劑組分別與單純?nèi)毖踅M相比無顯著差異(P>0.05)。單純?nèi)毖踅M較對照組(0.414±0.015)明顯增加(P<0.05)。

2.2 劃痕實驗結(jié)果缺氧+HIF-2α siRNA1組和缺氧+ HIF-2α siRNA2組細胞傷口愈合速度明顯慢于單純?nèi)毖踅M細胞，見圖1。

圖1　劃痕實驗結(jié)果(×100)

2.3 Boyden-chamber侵襲實驗結(jié)果缺氧+HIF-2α siRNA1組和缺氧+HIF-2α siRNA2組與單純?nèi)毖踅M相比穿過小室底膜的細胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，見圖2。

圖2　Boyden-chamber侵襲實驗結(jié)果

2.4 轉(zhuǎn)染24 h后各組細胞中MMP-2 蛋白和mRNA的表達缺氧+HIF-2α siRNA1組和缺氧+HIF-2α siRNA2組與單純?nèi)毖踅M相比，MMP-2蛋白和mRNA表達均下調(diào)(P<0.05)；缺氧+ HIF-2α siRNA1組、缺氧+ HIF-2α siRNA2組與對照組相比，MMP-2基因表達無明顯變化(P>0.05)，見表1，圖3。

表1　轉(zhuǎn)染24 h后各組細胞中MMP-2

與單純?nèi)毖踅M比較:1)P<0.05

1：對照組；2：單純?nèi)毖踅M；3：缺氧+HIF-2α siRNA1組；4：缺氧+HIF-2α siRNA2組 圖3　轉(zhuǎn)染24 h后各組細胞中MMP-2 mRNA和 蛋白的表達

3討論

腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的侵襲性和轉(zhuǎn)移性是影響其預(yù)后的重要因素，目前腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用受到了普遍關(guān)注。HIF-2α是1997年由Tian等克隆出的HIF家族新成員，定位于人染色體2p16-21，是由HIF-2α和HIF-1β兩種亞基組成的異源二聚體〔3〕；研究證實，除巨噬細胞外，HIF-2α蛋白在正常組織中表達較低或無表達，但可在多種腫瘤組織或細胞中表達，不同的腫瘤中其表達程度不一，并調(diào)節(jié)其生物學(xué)行為。最近有研究顯示〔4,5〕，在腎癌、滋養(yǎng)細胞腫瘤中應(yīng)用RNAi技術(shù)和反義寡核苷酸技術(shù)沉默HIF-2α表達后細胞增殖能力變化不明顯，但細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力明顯降低。在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中HIF-2α呈高表達，并且其表達與病理分期，組織內(nèi)微血管的密度，P53等蛋白的表達及患者的存活年限有顯著關(guān)系，這提示在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，HIF-2α可能通過促進新生血管形成而起作用〔6〕。這些發(fā)現(xiàn)使得HIF-2α有可能成為乳腺癌治療的一個切入點。

本研究結(jié)果顯示，HIF-2α siRNA能夠明顯抑制MCF-7細

胞中HIF-2α的表達，說明細胞轉(zhuǎn)染成功，并與Zimmer等〔7〕通過運用靶向HIF-2α的shRNA取得了實驗性腫瘤抑制的研究結(jié)果相符。本文結(jié)果表明HIF-2α能夠促進乳腺癌細胞MCF-7的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，并且HIF-2α siRNA 能有效抑制MCF-7細胞侵襲能力。Petrella等〔8〕在腎細胞癌的研究中亦證實了缺氧誘導(dǎo)因子2α可通過上調(diào)MTI-MMP的表達而增強細胞的體外侵襲能力。

MMP-2又稱Ⅳ型膠原酶或明膠酶，作為MMPs家族中降解細胞外基質(zhì)和基底膜中Ⅳ型膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵酶，在惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及間質(zhì)血管生成過程中起重要作用〔9〕。本研究結(jié)果提示HIF-2α促進的侵襲﹑轉(zhuǎn)移可能與MMP-2表達上調(diào)有關(guān)。

綜上，本研究采用RNAi技術(shù)初步證實了HIF-2α siRNA可能通過下調(diào)MMP-2的表達從而抑制MCF-7細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力，該研究結(jié)果為HIF-2α作為乳腺癌基因治療靶點的選擇提供了理論和實驗依據(jù)，本課題組擬對HIF-2α與MMP-2的作用關(guān)系進行深入研究。

4參考文獻

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〔2014-01-28修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)