丹參酮ⅡA對大鼠血管平滑肌細(xì)胞BIP和CHOP表達(dá)的影響

陳芳王 麗1沈曉君1王保奇1

(河南省人民醫(yī)院，河南鄭州450003)

摘要〔〕目的研究丹參酮ⅡA對同型半胱氨酸(HCY)誘導(dǎo)增殖血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)相關(guān)基因免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BIP)和C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(CHOP)表達(dá)的影響，探討丹參酮ⅡA促進(jìn)HCY誘導(dǎo)增殖VSMC凋亡的相關(guān)機(jī)制。方法大鼠VSMC原代培養(yǎng)、鑒定，建立HCY誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖模型，用不同濃度的丹參酮ⅡA干預(yù)，Annexin/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率；實時熒光定量PCR檢測BIP和CHOP表達(dá)量。結(jié)果丹參酮ⅡA可促進(jìn)VSMC凋亡，與HCY組比較差異顯著(P<0.05，P<0.01)；實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，HCY刺激使BIP和CHOP表達(dá)上調(diào)(P<0.05，P<0.01)；丹參酮ⅡA組劑量依賴性上調(diào)VSMC BIP表達(dá)，與HCY組比較差異顯著(P<0.05，P<0.01)；與HCY組比較，0.5 mg/L丹參酮ⅡA處理對大鼠VSMC CHOP表達(dá)無明顯影響，而1 mg/L丹參酮ⅡA使CHOP表達(dá)上調(diào)(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論丹參酮ⅡA可促進(jìn)HCY誘導(dǎo)增殖的VSMC凋亡，凋亡過程由核轉(zhuǎn)錄因子CHOP介導(dǎo)，BIP基因可能是其作用靶點之一。

關(guān)鍵詞〔〕丹參酮ⅡA；同型半胱氨酸；血管平滑肌細(xì)胞；BIP；CHOP

中圖分類號〔〕R285.5〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目(112300410051)；鄭州市科技創(chuàng)新團(tuán)隊資助項目(121PCXTD520)

通訊作者：沈曉君(1955-),女,教授,主要從事心血管疾病中醫(yī)藥防治研究。

1河南中醫(yī)學(xué)院

第一作者：陳芳(1986-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事心血管病研究。

動脈粥樣硬化(AS)及其所導(dǎo)致的心腦血管疾病是當(dāng)今人類死亡的首位原因,血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖是AS的主要形態(tài)特征，也是AS時內(nèi)膜肌層和內(nèi)皮損傷的重要標(biāo)志，許多危險因素可以通過促進(jìn)VSMC增殖等效應(yīng)引起AS病變形成〔1〕。本實驗通過觀察丹參酮ⅡA對同型半胱氨酸(HCY)誘導(dǎo)增殖的大鼠VSMC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)相關(guān)基因免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BIP)和C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(CHOP)表達(dá)的影響，探討丹參酮ⅡA促進(jìn)HCY誘導(dǎo)增殖VSMC凋亡的機(jī)制和可能的作用靶點。

1材料與方法

1.1 材料丹參酮ⅡA對照品購自中國藥品生物制品鑒定所,20 mg/瓶,批號：200619。HCY，Sigma公司產(chǎn)品，25 g/瓶,純度≥98%，批號：C-7352。瑞舒伐他汀(可定)，阿斯利康制藥有限公司，國A2002002。二氧化碳(CO2)恒溫培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)；FACS Calibur 流式細(xì)胞儀(BD，USA公司產(chǎn)品)；FLUOVIEW FV100共聚焦熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；DMEM、胰蛋白酶(Gibco BRL. USA產(chǎn)品)；Ⅱ型膠原酶 (Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量試劑盒、總RNA提取試劑(均為日本Takara公司產(chǎn)品)；α-SMA抗體(武漢博士德公司產(chǎn)品)；PCR擴(kuò)增儀(德國Whatman Biometra公司)；實時定量PCR儀(美國Applied Biosystem公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠VSMC原代培養(yǎng)雄性Wistar大鼠購自湖北省動物實驗中心，體質(zhì)量200~250 g，戊巴比妥鈉腹腔麻醉，迅速分離取出腹主動脈，小心剝除血管外膜，縱行剪開血管，PBS液洗2次，剪成0.5~2 mm大小的組織塊,放入含有1 mg/ml Ⅱ型膠原酶溶液的離心管中，37℃溫箱中消化30 min，劇烈震蕩離心管除去內(nèi)皮細(xì)胞后將組織塊取出，放入新鮮的1 mg/ml Ⅱ型膠原酶溶液中，繼續(xù)37℃溫箱中消化4~6 h，待組織塊呈絮狀后終止消化。離心，去上清，重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞長至75%匯合度時，消化傳代，取2~5代的血管平滑肌細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測細(xì)胞接種到6孔板中培養(yǎng)72 h后，去上清，PBS液洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，加入0.3%TritonX-100，倒掉后再加入TritonX-100室溫透化15 min，滴加30 μl血清封閉液(二抗宿主來源)室溫封閉30 min。加入一抗α-SMA抗體(1∶50)，4℃孵育過夜。加入FITC標(biāo)記羊抗小鼠二抗(1∶100)，37℃孵育30 min，同時加4′，6二脒基-2-苯吲哚鹽酸(4′,6-diamino-2-phenylindole，DAPI)染細(xì)胞核，37℃孵育30 min，封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 細(xì)胞分組與藥物干預(yù)取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞胰酶消化后制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml個。將處理好的蓋玻片放入6孔板各孔中，每孔準(zhǔn)確接種900 μl細(xì)胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)后將細(xì)胞分為空白組、HCY組、瑞舒伐他汀(可定)組和丹參酮ⅡA組。除空白組外，各組均加入劑量為10-4mol/L同型半胱氨酸，培養(yǎng)24 h后，可定組加入終濃度10 μmol/L的可定，丹參酮ⅡA組分別加入終濃度0.5 mg/L、1 mg/L的丹參酮ⅡA，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞。

1.2.4 Annexin V-PI法檢測細(xì)胞凋亡率各組PBS液洗滌，0.125%胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)移至離心管中，加入培養(yǎng)液，混勻后1 000 r/min離心，棄上清，加PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/ml，取0.5 ml細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心4 min，棄上清，加0.5 ml 上樣緩沖液重懸細(xì)胞，加入1 μl熒光標(biāo)記的Annexin V試劑，混勻后避光室溫下孵育20 min，加入5 μl PI，混勻后避光4℃下孵育5 min，加入500 μl上樣緩沖液，隨即用流式細(xì)胞儀檢測凋亡率，使用Flow max 2.4軟件。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測BIP和CHOP mRNA表達(dá)引物設(shè)計：BIP序列引物，正義：5′-GTTCTGCTTGATGTGTGTCC-3′，反義：5′-TTTGGTCATTGGTGATGGTG-3′；CHOP序列引物，正義：5′-CGCCTTCAACGACGAGTTCCTG-3′，反義：5′-GCTGTTCTTATCCACCGACTTC-3′；β-actin引物設(shè)計，正義引物：5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，反義：5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′。提取每組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。 PCR反應(yīng)體系為10 μl：SYBR Green I Mixture 5 μl，正義引物0.25 μl，反義引物0.25 μl，模板cDNA 1 μl，ddH2O 3.3 μl，Rox 0.2 μl，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性30 s；58℃退火40 s；72℃延伸40 s，共45個循環(huán)，每個樣本的RNA含量均根據(jù)各自的β-actin含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，2-△△CT法分析BIP和CHOP相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS10. 0軟件包進(jìn)行單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD方法。

2結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定倒置相差顯微鏡觀察，細(xì)胞多呈長梭形、核大，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色，胞核呈藍(lán)色，可見明顯的肌絲纖維。免疫組化結(jié)果顯示，超過98%的細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)特異性標(biāo)志蛋白α-SMA表達(dá)呈陽性，提示培養(yǎng)細(xì)胞為VSMC，見圖1。

圖1　大鼠VSMC原代細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定(×100)

2.2 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果丹參酮ⅡA、可定均可顯著促進(jìn)VSMC凋亡，可定組(7.11±0.21)、0.5 mg/L丹參酮ⅡA組(5.22±0.31)、1 mg/L丹參酮ⅡA組(13.67±0.25)大鼠VSMC凋亡百分率與HCY組(0.09±0.17)相比，差異顯著(P<0.05，P<0.01)。

2.3 丹參酮ⅡA對VSMC BIP和CHOP mRNA表達(dá)的影響實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，HCY刺激使BIP和CHOP表達(dá)上調(diào)(P<0.01)；丹參酮ⅡA組和可定組VSMC BIP mRNA表達(dá)均升高，與HCY組比較差異顯著(P<0.05，P<0.01)，且丹參酮ⅡA上調(diào)VSMC BIP mRNA表達(dá)存在劑量依賴性；與HCY組比較，0.5 mg/L丹參酮ⅡA處理對大鼠VSMC CHOP mRNA表達(dá)無明顯影響，而1 mg/L丹參酮ⅡA和可定均使CHOP mRNA表達(dá)顯著升高 (P<0.01)。見表1。

表1　丹參酮ⅡA對VSMC BIP和CHOP mRNA

與對照組比較：1)P<0.01；與HCY組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

3討論

VSMC向血管內(nèi)膜遷移、增殖是AS的主要病理特征之一，VSMC通過其表面的受體結(jié)合、攝取脂質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榧≡葱耘菽?xì)胞，與炎癥細(xì)胞、細(xì)胞外脂質(zhì)及粥樣壞死組織等構(gòu)成AS斑塊。遷移、增殖的VSMC不僅是AS斑塊的主要細(xì)胞成分，而且呈合成型改變的VSMC還可分泌大量的細(xì)胞因子和生長因子，刺激更多的VSMC遷移、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白形成，促進(jìn)AS病變發(fā)生發(fā)展〔2，3〕。因此，抑制VSMC的過度增殖是延緩或逆轉(zhuǎn)AS病變的有效途徑。HCY是蛋氨酸在體內(nèi)分解代謝的中間產(chǎn)物，大量的流行病學(xué)調(diào)查表明高HCY血癥是AS新的獨(dú)立危險因素。研究證實高HCY血癥致AS的作用與其促進(jìn)VSMC增殖有關(guān)〔4〕。Zhang等〔5〕研究表明，HCY可通過內(nèi)皮細(xì)胞中血小板源性生長因子DNA脫甲基作用而激活VSMC，促進(jìn)其增殖。

BIP又稱葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)，是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上重要的分子伴侶，參與阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)新生肽聚集、調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)以及啟動未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)等細(xì)胞生命過程。真核細(xì)胞的膜蛋白及分泌性蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成后經(jīng)翻譯后修飾、折疊和組裝，由高爾基體進(jìn)一步加工后轉(zhuǎn)運(yùn)到膜上或分泌到胞外。當(dāng)各種因素作用下新生肽鏈的修飾折疊與組裝受到干擾，將引起未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中堆積，使細(xì)胞產(chǎn)生ERS，細(xì)胞經(jīng)由上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白表達(dá)等相關(guān)機(jī)制啟動UPR，以降低蛋白合成速率，恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定〔6〕。存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的RNA依賴性蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、轉(zhuǎn)錄激活因子6(ATF6)及需肌醇酶1(IRE1)是感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)應(yīng)激信號的一類跨膜感受蛋白。3種跨膜感應(yīng)蛋白，常態(tài)下PERK、ATF6、IRE1分別與BIP結(jié)合形成復(fù)合物，處于無活性狀態(tài)。當(dāng)ERS發(fā)生時，3種信號感受蛋白與BIP解離，BIP轉(zhuǎn)而與未折疊蛋白相結(jié)合，促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊，在一定程度上減輕或消除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)折疊功能的負(fù)荷，因此UPR是細(xì)胞的一種適應(yīng)性保護(hù)機(jī)制。當(dāng)ERS過于強(qiáng)烈持久，大量與BIP解離的PERK、ATF6、IRE1可誘導(dǎo)CHOP的轉(zhuǎn)錄，從而激活CHOP/GADD153細(xì)胞凋亡通路。CHOP是聯(lián)系ERS與細(xì)胞凋亡的重要中間信號分子，CHOP高表達(dá)可通過抑制凋亡負(fù)調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2等多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔7〕。

丹參酮ⅡA是從丹參中提取出來的脂溶性有效成分之一，具有改善微循環(huán)，降壓，擴(kuò)張冠狀動脈，抑制血小板聚集，抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，抗心肌肥厚等廣泛的藥理學(xué)作用，廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療〔8〕。前期的研究發(fā)現(xiàn)，ERS可能是AS時VSMC增殖失控的機(jī)制之一，丹參酮ⅡA可通過ERS途徑干預(yù)兔AS病變〔9〕。本研究結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA可促進(jìn)大鼠VSMC凋亡，與HCY組比較差異顯著，進(jìn)一步支持丹參酮ⅡA通過抑制VSMC增殖而發(fā)揮抗AS 作用的理論，ERS與丹參酮ⅡA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程有關(guān)，丹參酮ⅡA誘導(dǎo)的VSMC凋亡過程由核轉(zhuǎn)錄因子CHOP介導(dǎo)。ERS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被認(rèn)為是除死亡受體活化和線粒體損傷外又一條新的介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)的通路，CHOP作為一種轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)決定細(xì)胞的生存與死亡。本實驗結(jié)果表明丹參酮ⅡA可上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白BIP基因表達(dá)使凋亡信號放大，通過CHOP轉(zhuǎn)錄激活誘導(dǎo)過度增殖的VSMC凋亡，但CHOP誘導(dǎo)凋亡的下游信號機(jī)制還需要進(jìn)一步的深入研究。

4 參考文獻(xiàn)

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2Chen S,Ding Y,Tao W,etal.Naringenin inhibits TNF-alpha induced VSMC proliferation and migration via induction of HO-1〔J〕.Food Chem Toxicol,2012;50(9):3025-31.

3Perez J,Torres RA,Rocic P,etal.PYK2 signaling is required for PDGF-dependent vascular smooth muscle cell proliferation〔J〕.Am J Physiol Cell Physiol,2011;301(1):242-51.

4Liu X,Shen J,Zhan R,etal.Proteomic analysis of homocysteine induced proliferation of cultured neonatal rat vascular smooth muscle cells〔J〕.Biochim Biophys Acta,2009;1794(2):177-84.

5Zhang D,Chen Y,Xie X,etal.Homocysteine activates vascular smooth muscle cells by DNA demethylation of platelet-derived growth factor in endothelial cells〔J〕.J Mol Cell Cardiol,2012;53(4):487-96.

6Chakrabarti A,Chen AW,Varner JD. A review of the mammalian unfolded protein response〔J〕.Biotechnol Bioeng,2011;108(12):2777-93.

7周雪瓊,賀凌飛,余日安.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及未折疊蛋白反應(yīng)通路研究進(jìn)展〔J〕.中國職業(yè)醫(yī)學(xué),2012;39(3):264-7.

8楊征,邱敏.丹參酮ⅡA的心血管作用及機(jī)制研究進(jìn)展〔J〕.中國動脈粥樣硬化雜志,2011;19(4):372-4.

9沈曉君,高愛社,關(guān)懷敏,等.丹參酮ⅡA對兔動脈粥樣硬化病灶凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2013;33(1):90-2.

〔2013-12-16修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)