燈盞乙素對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠缺血側(cè)腦組織熱休克蛋白70表達(dá)的影響

王龍梓

(淄博職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，山東淄博255314)

摘要〔〕目的觀察燈盞乙素對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠缺血側(cè)腦組織熱休克蛋白(HSP)70表達(dá)的影響。方法采用大腦中動(dòng)脈栓線阻斷法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，免疫組化和RT-PCR檢測(cè)燈盞乙素對(duì)大鼠缺血損傷腦組織HSP70蛋白和mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果燈盞乙素可明顯增強(qiáng)缺血再灌注損傷大鼠缺血側(cè)腦組織HSP70蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)論燈盞乙素可明顯增強(qiáng)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷腦組織HSP的表達(dá)，這可能與其腦保護(hù)作用有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕燈盞乙素；腦缺血；熱休克蛋白(HSP)70；HSP70 mRNA

中圖分類號(hào)〔〕R749〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

第一作者：王龍梓(1976-)，男，碩士，講師，主要從事心腦血管藥理學(xué)研究。

燈盞花素是從燈盞細(xì)辛中提取的黃酮類成分，燈盞乙素為燈盞花素的主要藥效成分。燈盞乙素和燈盞花素的腦保護(hù)作用機(jī)制復(fù)雜，至今尚不清楚。熱休克蛋白(HSP)70為急性腦損傷后腦組織表達(dá)的一種應(yīng)激保護(hù)蛋白，可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和死亡，維持神經(jīng)細(xì)胞功能，具有多種腦保護(hù)作用。劉萍等〔1〕發(fā)現(xiàn)腦保護(hù)藥黃芩苷可使局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織海馬部位HSP70表達(dá)明顯增加。燈盞乙素又名野黃芩苷，與黃芩苷結(jié)構(gòu)相似(黃芩苷4′位引入一個(gè)羥基即為燈盞乙素，見圖1)，但其治療用藥對(duì)腦缺血后HSP70表達(dá)的影響未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬應(yīng)用大腦中動(dòng)脈栓線阻斷法構(gòu)建大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，檢測(cè)燈盞乙素治療給藥對(duì)缺血腦組織HSP70蛋白和mRNA表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1藥品與試劑燈盞乙素，云南玉溪萬(wàn)方天然藥物有限公司，批號(hào)：020509；尼莫地平，山東健康藥業(yè)有限公司，批號(hào)：0401402-H；多聚甲醛：浙江菱湖振興助劑廠，批號(hào)：960508。兔抗大鼠HSP70多克隆抗體：美國(guó)Newmark公司產(chǎn)品，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供。即用型第二代免疫組化ElivisionTMplus試劑盒(Kit-9901)、DAB顯色試劑盒：福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。Trizol：上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

圖1　燈盞乙素與黃芩苷分子式

1.2儀器C-5050ZOOM數(shù)碼照相機(jī)：日本OLYMPUS公司。醫(yī)學(xué)形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)：江蘇捷達(dá)科技發(fā)展有限公司。MiniCyclerTM 擴(kuò)增儀：美國(guó)PERKIN ELMER(PE)公司。DY-600 中壓電泳儀：美國(guó)BECTON DICKINSON(BD)公司。

1.3動(dòng)物分組與模型制備Wistar大鼠，健康雄性，體重270~300 g，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(魯)20030004。隨機(jī)分為6組：即假手術(shù)組，缺血再灌注損傷組(IR組)，尼莫地平組(尼莫地平0.4 mg·kg)，燈盞乙素低、中、高劑量組(燈盞乙素12.5 、25 和50 mg/kg)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉后，采用大腦中動(dòng)脈內(nèi)栓線阻斷法(CAO)制備大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞模型，1 h后拔線實(shí)現(xiàn)再灌注。按上述劑量分別于缺血后和再灌注后立即靜脈給藥1次(每次給半量)。

1.4逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)HSP70 mRNA的表達(dá)腦缺血1 h再灌注24 h后處死大鼠，取大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)腦組織50 mg，應(yīng)用Trizol法進(jìn)行組織總RNA的提取，冰上逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。以β-actin為內(nèi)參照，引物參照文獻(xiàn)〔2〕，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以目的基因和內(nèi)參照(β-actin)基因譜帶的積分光密度比值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HSP70蛋白表達(dá)大鼠腦缺血1 h再灌注24 h麻醉后仰臥固定，快速剪開腹腔和胸腔前壁，清晰暴露出心臟和升主動(dòng)脈，用連有輸液管的預(yù)處理為鈍圓的針頭由心尖處插入左心室，并通過(guò)心腔插入升主動(dòng)脈，應(yīng)用4℃ pH=7.4的4%多聚甲醛進(jìn)行快速全身灌流固定。灌流結(jié)束后斷頭取腦，常規(guī)梯度脫水，透明，石蠟包埋。取缺血側(cè)背側(cè)海馬常規(guī)4 μm連續(xù)冠狀切片。切片進(jìn)行HSP70蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè)。以Elivision兩步法染色，參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。胞質(zhì)或胞核內(nèi)有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。利用醫(yī)學(xué)形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定海馬CA1區(qū)陽(yáng)性染色的平均光密度與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算大鼠神經(jīng)細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)(PEI)：PEI=平均光密度×陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1燈盞乙素對(duì)大鼠缺血側(cè)腦組織HSP70 mRNA表達(dá)的影響假手術(shù)組HSP70 mRNA表達(dá)弱(0.27±0.03)，IR組HSP70 mRNA表達(dá)明顯增加(0.71±0.13，P<0.001)；低、中、高劑量燈盞乙素組和尼莫地平組HSP70 mRNA表達(dá)進(jìn)一步升高，均明顯高于IR組(0.90±0.03、0.98±0.05、0.95±0.07、0.81±0.97，P<0.001)。見圖2。

2.2燈盞乙素對(duì)大鼠缺血側(cè)腦組織HSP70蛋白表達(dá)的影響假手術(shù)組棕黃色HSP70蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞少見，且胞質(zhì)著色淡(PEI為3.87%±2.51%)。IR組缺血側(cè)腦組織可見棕黃色HSP70蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，主要分布于皮層、海馬及紋狀體等區(qū)域，其中海馬區(qū)表達(dá)最強(qiáng)(PEI為19.14%±3.14%)。低、中、高劑量燈盞乙素組及尼莫地平組棕黃色HSP70蛋白表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，海馬區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞密集分布，且陽(yáng)性細(xì)胞質(zhì)著色深(PEI分別為31.90%±7.03%、37.97%±4.65%、50.40%±4.94%、30.76%±4.31%)。各用藥組HSP70蛋白表達(dá)在模型組基礎(chǔ)上進(jìn)一步明顯升高(P<0.001)。見圖3。

1：假手術(shù)組，2：IR組，3：燈盞乙素低劑量組，4：燈盞乙素中劑量組，5：燈盞乙素高劑量組，6：尼莫地平組 圖2　燈盞乙素對(duì)大鼠腦缺血側(cè)海馬CA1區(qū) HSP70 mRNA表達(dá)的影響

圖3　免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠腦缺血側(cè)海馬CA1區(qū)HSP70蛋白的表達(dá)(DAB，×400)

3討論

HSP被稱為分子伴侶，參與蛋白質(zhì)的正常折疊，使其成為功能蛋白質(zhì)。HSP中以熱休克蛋白70(HSP70)進(jìn)化最為保守，在大多數(shù)生物中含量高。正常情況下HSP70 mRNA在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，但很快降解，故HSP70 mRNA在正常細(xì)胞表達(dá)水平低，HSP70合成較少。腦缺血可誘導(dǎo)HSP70 mRNA的表達(dá)，組織學(xué)檢查顯示預(yù)缺血能夠顯著減少大鼠全腦缺血模型腦缺血敏感區(qū)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡數(shù)量。研究顯示， 預(yù)缺血誘導(dǎo)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)蛋白伴侶HSP70 在再灌注后24 h表達(dá)，提示預(yù)缺血可能通過(guò)誘導(dǎo)蛋白伴侶HSP70的表達(dá)減少再缺血引起的神經(jīng)元死亡〔3〕。為了使外源性的HSP70發(fā)揮作用，有人將HSP70與分子轉(zhuǎn)運(yùn)體重組，制備Fv-HSP70，用于腦缺血再灌注損傷SD大鼠，具有明顯腦保護(hù)作用〔4〕。

HSP70的腦保護(hù)作用機(jī)制主要是其分子伴侶作用，多基于HSP70基因敲除，通過(guò)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或熱應(yīng)激制備的基因過(guò)表達(dá)模型。HSP70可通過(guò)抑制氧自由基，抑制細(xì)胞凋亡等機(jī)制產(chǎn)生腦保護(hù)作用，HSP70也調(diào)節(jié)炎癥通路。研究顯示，幾種藥物能抑制HSP90，誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)，影響神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)來(lái)保護(hù)腦率中和腦損傷〔5〕。

多種化學(xué)藥物可促進(jìn)腦缺血損傷后HSP70的表達(dá)?？拱d癇藥丙戊酸具有神經(jīng)保護(hù)作用。有學(xué)者制備大鼠短暫性全腦缺血再灌注損傷模型，給予丙戊酸治療，全腦缺血再灌注7 h后指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，丙戊酸可明顯改善大鼠認(rèn)知功能缺損，明顯增加大鼠全腦缺血再灌注后大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度，而誘導(dǎo)大鼠大腦海馬組織HSP70表達(dá)是上述腦保護(hù)作用的重要機(jī)制〔6〕。去卵巢大鼠慢性腦組織灌注不足14 d，缺血敏感區(qū)海馬組織神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，丙二醛(MDA)增加，HSP70表達(dá)增加，超氧化物歧化酶(SOD)和還原型谷胱甘肽(GSH)活性降低。而褪黑素應(yīng)用后，與缺血模型組相比，SOD，GSH活性水平恢復(fù)，誘導(dǎo)HSP70表達(dá)增加，提示褪黑素可有助于血管性癡呆和腦灌注不足的治療〔7〕。

關(guān)于植物藥活性成分促進(jìn)HSP70表達(dá)的研究不少學(xué)者關(guān)注黃芩苷。將沙鼠雙側(cè)頸動(dòng)脈阻斷5 min，阻斷時(shí)立即腹腔注射黃芩苷200 mg/kg，再灌注7 d后，結(jié)果顯示黃芩苷明顯改善神經(jīng)功能缺損，明顯增加增加海馬部位HSP70表達(dá)，提示黃芩苷可通過(guò)增加HSP70的表達(dá)對(duì)沙鼠全腦缺血產(chǎn)生保護(hù)作用〔8〕。劉萍等〔1〕將黃芩苷用于局灶性腦缺血1 h,再灌注24 h大鼠，發(fā)現(xiàn)腦組織海馬部位HSP70表達(dá)明顯增加。但黃芩苷劑量需用至100 mg/kg，腦組織海馬部位HSP70表達(dá)方明顯強(qiáng)于模型組。本研究提示燈盞乙素促進(jìn)缺血腦組織作用HSP70表達(dá)的作用可能強(qiáng)于黃芩苷。所以本研究認(rèn)為，需要進(jìn)一步深入研究HSP70表達(dá)保護(hù)腦缺血損傷的機(jī)制，進(jìn)一步研究燈盞乙素等天然藥物促進(jìn)腦缺血再灌注損傷后HSP70表達(dá)強(qiáng)度不同的原因，從而為找到理想的腦缺血損傷保護(hù)藥提供思路。

4參考文獻(xiàn)

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〔2013-11-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)