免疫細(xì)胞化學(xué)和形態(tài)學(xué)分析對(duì)良惡性胸腹水鑒別診斷的作用

王志祥趙秀平1禹立芳2劉桂清3

(河北北方學(xué)院解剖教研室，河北張家口075000)

摘要〔〕目的探討免疫細(xì)胞化學(xué)和形態(tài)學(xué)分析在胸腹水細(xì)胞學(xué)鑒別診斷中的意義。 方法選取河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，呼吸內(nèi)科的良、惡性胸腹水患者各30例，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)癌胚抗原(CEA)、上皮膜抗原(EMA)、波形蛋白的表達(dá)，同時(shí)應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)定量測(cè)定其脫落細(xì)胞的核面積、質(zhì)面積、核質(zhì)比、細(xì)胞周長(zhǎng)、平均直徑、圓度和形狀因子。 結(jié)果①惡性胸腹水中腺癌細(xì)胞(B組)CEA表達(dá)均陽(yáng)性，EMA部分陽(yáng)性，波形蛋白均陰性；增生性間皮細(xì)胞(A組)EMA和波形蛋白部分陽(yáng)性，CEA均陰性。CEA單獨(dú)診斷的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值均最好，聯(lián)合檢測(cè)EMA+波形蛋白組合的敏感性和特異性較好。②良惡性標(biāo)本的細(xì)胞形態(tài)學(xué)測(cè)量結(jié)果顯示：良性組標(biāo)本的面積、周長(zhǎng)等效直徑、長(zhǎng)徑、短徑與惡性標(biāo)本間存在明顯差異，良性組明顯低于惡性組(P<0.05)；變異系數(shù)在兩組間比較顯示良性組標(biāo)本的面積、周長(zhǎng)等效直徑、長(zhǎng)徑、短徑與惡性標(biāo)本間存在明顯差異，良性組明顯低于惡性組(P<0.05)。 結(jié)論①免疫細(xì)胞化學(xué)在良惡性胸腹水鑒別診斷中有重要作用，CEA單獨(dú)診斷以及EMA+波形蛋白聯(lián)合檢測(cè)均可獲得較好的敏感性、特異性；②形態(tài)學(xué)定量分析可為鑒別診斷提供參考， 二者綜合分析是提高胸腹水細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性診斷率的有效途徑之一。

關(guān)鍵詞〔〕免疫細(xì)胞化學(xué)；形態(tài)學(xué)分析； 腹水； 間皮細(xì)胞； 胸腔積液

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R322.4+92〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

1張家口市食品化妝品監(jiān)督所2張家口市橋東區(qū)惠民醫(yī)院

3中國(guó)人民解放軍251醫(yī)院

第一作者：王志祥(1971-)，男，碩士，講師，主要從事解剖學(xué)教學(xué)和消化系統(tǒng)疾病研究。

傳統(tǒng)方法通過(guò)對(duì)胸腔和腹腔積液進(jìn)行脫落細(xì)胞學(xué)檢查以判定疾病的性質(zhì)，但由于退變的腺癌細(xì)胞和增生性間皮細(xì)胞外形不易鑒別以及炎癥干擾、細(xì)胞退變等因素影響脫落細(xì)胞學(xué)的診斷，因此臨床實(shí)踐中良惡性胸腹水的鑒別仍是困擾臨床的難題。腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌多種細(xì)胞因子，參與其血管新生和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，已有研究在探究敏感的腫瘤標(biāo)記物對(duì)早期惡性胸腹水做出診斷，而本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)定量分析，探討二者在胸腹水診斷和鑒別診斷中的意義。

1材料和方法

1.1臨床資料收集2011年1月至2012年1月在河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科、呼吸內(nèi)科住院患者共60例，其中良性組(A組)30例，包括18例結(jié)核性胸水，胸部CT檢查、PPD實(shí)驗(yàn)以及痰中結(jié)核桿菌陽(yáng)性診斷；12例肝硬化腹水，腹部B超診斷、肝功谷草轉(zhuǎn)氨酶升高、乙肝系列表面抗原陽(yáng)性，男15例,女15例,年齡18～71〔平均(45.4±3.8)〕歲；惡性組(B組)30例，其中15例血性胸水，支氣管鏡或胸膜活檢病理證實(shí)為肺腺癌；15例腹水，胃鏡活檢或腹腔鏡活檢診斷為胃癌或卵巢癌，男21例,女9例，年齡39～79〔平均(59.7±4.5)〕歲，兩組患者的年齡，性別比例無(wú)明顯差別(P>0.05)，存在可比性。

1.2實(shí)驗(yàn)方法患者入院確診后即刻抽取新鮮胸腹水，沉淀5 min后，留取沉淀部分約10 ml，在自動(dòng)涂片離心機(jī)(日本櫻花精密機(jī)械有限公司產(chǎn)品)離心10 min (2 100 r/min)，棄上清液，將沉淀在載玻片上的細(xì)胞均勻涂在常規(guī)HE染色的玻片，每例一張，在抹有APES載玻片上涂片，每例3張，稍干后，一張常規(guī)涂片放入950 ml/L乙醇中固定15 min，HE染色，置于40倍鏡下觀察，選擇細(xì)胞密集重疊較少的區(qū)域采圖， 使用CMIAS真彩色病理圖像分析系統(tǒng)采集細(xì)胞涂片的顯微圖像， 然后選擇細(xì)胞分布較均勻、細(xì)胞邊界清晰的視野采集4～10幅400倍圖片,保證有核細(xì)胞200個(gè)以上，對(duì)有核細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分割，輔以手工分割，對(duì)分割出的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行各種形態(tài)學(xué)參數(shù)自動(dòng)測(cè)量，采集的細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)如下： ①面積； ②周長(zhǎng)； ③等效直徑；④長(zhǎng)徑；⑤短徑；⑥長(zhǎng)短徑比；⑦形狀因子；⑧圓形度；⑨異形指數(shù)。 良性與惡性標(biāo)本間細(xì)胞形態(tài)學(xué)對(duì)其所示細(xì)胞在 (北京航天大學(xué)圖像中心與空軍總醫(yī)院圖像開(kāi)發(fā)組產(chǎn)品，CMIAS型,WINDOW98軟件)下測(cè)細(xì)胞核、質(zhì)的面積、核質(zhì)比例、細(xì)胞周長(zhǎng)、平均直徑、圓度、形狀因子，分割，編輯，統(tǒng)計(jì)，獲得脫落細(xì)胞形態(tài)學(xué)原始數(shù)據(jù)， 對(duì)重疊細(xì)胞、紅細(xì)胞或淋巴細(xì)胞予以棄除。 在同一制片、同種染色及光照條件下，每例測(cè)定分析細(xì)胞50個(gè)，校正因子1.1， 抹有APES的涂片稍干后即放入乙醚乙醇液(1∶1)中固定15 min，水洗， 固定后的涂片先用蒸餾水沖洗，再用PBS沖洗3次后，滴加A液(50 ml/L正常羊血清)適量，在室溫、濕盒內(nèi)各封閉10 min，37℃孵育1 h，PBS沖洗，每次5 min，再依次滴加BC液(二抗及SP液)，室溫放置30 min。免疫細(xì)胞化學(xué)染色采用SP法，三種鼠抗人單克隆抗體均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司，其工作濃度分別為癌胚抗原(CEA，1∶350)，上皮膜抗原(EMA，1∶150)，波形蛋白(1∶40)，試劑公司提供的已知陽(yáng)性胸腹水涂片作為陽(yáng)性對(duì)照，以 PBS代替一抗作陰性對(duì)照，CEA、波形蛋白的陽(yáng)性物質(zhì)位于細(xì)胞質(zhì)，而EMA得陽(yáng)性物質(zhì)位于細(xì)胞膜。結(jié)果按照每張涂片的陽(yáng)性細(xì)胞比例及著色深淺計(jì)分進(jìn)行判定分析， 陽(yáng)性細(xì)胞所占比例判斷，無(wú)著色0分，1/3以下著色為1分，1/3～2/3為2分，2/3以上為3分， 陽(yáng)性強(qiáng)度，無(wú)著色0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。 2項(xiàng)相乘0分為-，1～3分為+，4～6分為，7～9分為；將-視為陰性、+視為弱陽(yáng)性、視為陽(yáng)性、視為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.0軟件進(jìn)行χ2及t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1不同組間細(xì)胞形態(tài)和免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果觀察A組涂片中以增生性間皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，間皮細(xì)胞單個(gè)散在或成片排列,大小略不一致，細(xì)胞核呈圓或卵圓形、多居中，核膜清楚，染色質(zhì)勻細(xì)，有小核仁，胞質(zhì)豐富，淡伊紅色； B組涂片，癌細(xì)胞呈團(tuán)、腺樣、乳頭樣或散在，細(xì)胞大小不一，互相擁擠，核大，大小形狀不一致,核膜厚，染色質(zhì)粗且分布不均勻，核仁明顯，胞質(zhì)較少，內(nèi)可見(jiàn)空泡，可有病理性核分裂像。 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果A，B兩組有差別，惡性胸腹水中腺癌細(xì)胞(B組)CEA表達(dá)均陽(yáng)性，EMA部分陽(yáng)性(24例)，波形蛋白均陰性；增生性間皮細(xì)胞(A組)EMA(12例)和波形蛋白(15例)部分陽(yáng)性，CEA均陰性。見(jiàn)圖1。

圖1　不同組細(xì)胞CEA、EMA、波形蛋白表達(dá)(DAB，×200)

2.2單獨(dú)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)的敏感性、特異性、陰陽(yáng)性預(yù)測(cè)值對(duì)比分析CEA的敏感性和特異性均最好，波形蛋白特異性較好，EMA敏感性和特異性居中，聯(lián)合檢測(cè)組以EMA+ 波形蛋白組合的敏感性和特異性較好。見(jiàn)表1。

表1三種免疫細(xì)胞化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)的敏感性、特異性、陰(陽(yáng))性預(yù)測(cè)值的對(duì)比分析

指標(biāo)敏感性特異性陽(yáng)性預(yù)測(cè)值陰性預(yù)測(cè)值CEAEMA波形蛋白CEA+波形蛋白EMA+波形蛋白CEA+EMA100%83.3%66.7%66.7%76.9%71.4%100%75%100%50%70%60%100%80%100%66.7%76.9%71.4%100%60%50%50%70%60%

2.3不同組別間細(xì)胞形態(tài)學(xué)測(cè)定結(jié)果及變異系數(shù)的比較良性組標(biāo)本的面積、周長(zhǎng)等效直徑、長(zhǎng)徑、短徑與惡性標(biāo)本間存在明顯差異，A組明顯低于B組(P<0.05)；變異系數(shù)在兩組間比較顯示良性組標(biāo)本的面積、周長(zhǎng)等效直徑、長(zhǎng)徑、短徑與惡性標(biāo)本間存在明顯差異，A組明顯低于B組(P<0.05)。見(jiàn)表2，表3。

表2良惡性胸腹水標(biāo)本脫落細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果比較(n=30)

參數(shù)A組B組P值面積(μm2)周長(zhǎng)(μm)等效直徑(μm)長(zhǎng)徑(μm)短徑(μm)長(zhǎng)短比形狀因子圓形度異形指數(shù)48.00±13.1813.01±3.533.56±0.564.90±1.193.27±0.951.11±0.031.02±0.030.94±0.023.25±0.03142.02±35.0136.52±6.8310.43±2.7912.49±4.14110.05±3.511.14±0.041.04±0.0230.92±0.023.369±0.040.0010.0010.0010.0010.0020.11340.13520.62190.4512

表3良惡性胸腹水標(biāo)本脫落細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)變異系數(shù)比較

參數(shù)A組B組P值面積(μm2)周長(zhǎng)(μm)等效直徑(μm)長(zhǎng)徑(μm)短徑(μm)長(zhǎng)短比形狀因子圓形度異形指數(shù)0.41±0.170.29±0.140.38±0.140.24±0.040.318±0.090.11±0.060.74±0.030.05±0.010.05±0.011.988±0.510.77±0.250.974±0.240.74±0.220.873±0.210.13±0.130.78±0.0240.08±0.030.06±0.040.0010.0010.0010.0010.0010.17620.27250.25540.3562

3討論

炎癥刺激和惡性腫瘤的播散都會(huì)導(dǎo)致胸腹膜腔的滲出增加，臨床診斷中多依靠脫落細(xì)胞學(xué)的形態(tài)判別和生化指標(biāo)的升高，如蛋白濃度、李凡他實(shí)驗(yàn)等，但是由于增生的間皮細(xì)胞形態(tài)變化多樣，且滲出液中的理化環(huán)境對(duì)細(xì)胞的形態(tài)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，使很多樣本無(wú)法做出及時(shí)的判別，而且滲出液中的生化指標(biāo)也會(huì)因炎癥刺激的持續(xù)、惡性腫瘤細(xì)胞的廣泛壞死等因素而產(chǎn)生誤判。目前的研究也在試圖尋找特異的針對(duì)抗體以區(qū)分胸腹水的性質(zhì)，但是目前仍沒(méi)有一種抗體對(duì)哪種腫瘤是絕對(duì)特異性的〔1，2〕。因此多種抗體的聯(lián)合篩查必然是增加檢出率的科學(xué)手段。

CEA是一組酸性糖蛋白，廣泛存在于各種上皮源性腫瘤，尤其是各種腺癌細(xì)胞中表達(dá)陽(yáng)性，體腔間皮細(xì)胞中不含CEA，因而是鑒別腺癌和增生性間皮細(xì)胞的重要生物學(xué)標(biāo)記物〔3，4〕。 EMA在腺癌中呈陽(yáng)性表達(dá)，間皮細(xì)胞呈弱陽(yáng)性，可配合其他指標(biāo)鑒別診斷。 波形蛋白是間葉源性腫瘤標(biāo)記物，絕大多數(shù)上皮源性腫瘤為陰性表達(dá)，間皮細(xì)胞為陽(yáng)性， 因而可區(qū)分腺癌與增生性間皮細(xì)胞〔3～5〕。 本實(shí)驗(yàn)選用的這一組特異性抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)表達(dá)，在胸腹水中腺癌細(xì)胞和增生性間皮細(xì)胞鑒別診斷方面有重要作用。本研究顯示CEA的敏感性和特異性均最好，說(shuō)明脫落細(xì)胞CEA抗原的陽(yáng)性表達(dá)是診斷惡性腫瘤的客觀標(biāo)準(zhǔn)；同時(shí)部分良性腹水出現(xiàn)EMA的異常表達(dá)和波形蛋白的表達(dá)缺失，惡性腹水中EMA的表達(dá)缺失和波形蛋白的異常表達(dá)。這種情況在多種實(shí)體瘤中存在，已有的研究顯示多種上皮來(lái)源的腫瘤在演進(jìn)的過(guò)程中，上皮膜的黏附分子出現(xiàn)低表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞形態(tài)梭形變，并表達(dá)間葉組織表型，即上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換〔6～8〕。推測(cè)本實(shí)驗(yàn)的可能原因是部分腫瘤細(xì)胞在分化過(guò)程中失去上皮細(xì)胞的免疫表型，同時(shí)獲得間葉組織的免疫表型，完成上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換，使腫瘤呈現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲性惡性程度增加，導(dǎo)致包括腹水在內(nèi)的不良體征。因此如果單獨(dú)應(yīng)用一種抗體進(jìn)行篩選，可能出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性，而多種抗體聯(lián)合應(yīng)用可能在腹水鑒別診斷中有價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)照病理診斷顯示：波形蛋白對(duì)良、惡性腹水鑒別價(jià)值特異性較好，EMA敏感性和特異性居中，而聯(lián)合檢測(cè)組以EMA+波形蛋白組合的敏感性和特異性較好。因此，免疫細(xì)胞化學(xué)用于良、惡性胸腹水的鑒別診斷，具有與組織學(xué)同等的價(jià)值，同時(shí)聯(lián)合檢測(cè)提高了陽(yáng)性診斷率。

傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)診斷主要依據(jù)細(xì)胞的大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)、細(xì)胞的產(chǎn)物(如黏液)等，惡性細(xì)胞有細(xì)胞核的改變(如核增大、深染、核漿比失調(diào)，染色質(zhì)分布不均勻等)，細(xì)胞互相擁擠等， 有一定的主觀性。 信息技術(shù)的發(fā)展為細(xì)胞學(xué)診斷的數(shù)字化客觀評(píng)價(jià)提供了可能。國(guó)外學(xué)者〔9，10〕用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對(duì)胸腹腔滲出液的細(xì)胞學(xué)涂片分析,發(fā)現(xiàn)惡性組的核長(zhǎng)軸長(zhǎng)度和核面積兩個(gè)參數(shù)與良性組有顯著差異； 國(guó)內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)脫落細(xì)胞的面積、周長(zhǎng)、最大和最小直徑、形狀因子、核質(zhì)比等6項(xiàng)形態(tài)學(xué)參數(shù)在82例良性與惡性胸/腹水組間差異有顯著性意義，但相關(guān)研究多是在剔除胸/腹水中的淋巴細(xì)胞而得出的結(jié)論， 存在人為選擇細(xì)胞進(jìn)行分析的主觀因素。而本研究對(duì)所采集的圖像視野內(nèi)所有有核細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)定量測(cè)定，更為客觀地反映了標(biāo)本脫落細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)；另外，多數(shù)研究涉及胞核的形態(tài)學(xué)參數(shù)， 盡管后者可有一定的診斷價(jià)值， 但本研究發(fā)現(xiàn)， 軟件的核分割效果比細(xì)胞分割差， 常需要輔以手工分割， 實(shí)際應(yīng)用和準(zhǔn)確性都有所限制。 因此，本研究?jī)H以自動(dòng)分割效果良好的細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析，在實(shí)踐中也方便和實(shí)用。隨著計(jì)算機(jī)輔助診斷技術(shù)和數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)的臨床應(yīng)用不斷深入，定量診斷和自動(dòng)化診斷成為診斷學(xué)的重要發(fā)展趨勢(shì)， 也為胸/腹水的鑒別診斷開(kāi)辟了新的途徑。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)研究報(bào)告的一致，說(shuō)明細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察和實(shí)際測(cè)量存在一致性，細(xì)胞形態(tài)學(xué)定量分析在鑒別良惡性胸腹水中有一定的作用，快速、可行，且客觀性強(qiáng)；同時(shí)為形態(tài)學(xué)定量分析提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 兩組胸腹水中細(xì)胞的圓度無(wú)顯著差異，可能與圖像預(yù)處理(如分割等)，灰度等原因有關(guān)。由于高分化腺癌與增生性間皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)參數(shù)閾值缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，尚待進(jìn)一步研究。因此，圖像分析對(duì)良惡性胸腹水的鑒別僅提供參考，仍需結(jié)合光鏡下細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)和免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果。

總之，免疫細(xì)胞化學(xué)在良惡性胸腹水鑒別診斷中有重要價(jià)值，形態(tài)學(xué)定量分析可提供參考，二者綜合分析對(duì)鑒別腺癌和增生性間皮細(xì)胞具有重要作用，是提高胸腹水陽(yáng)性診斷率的有效途徑之一。

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〔2013-06-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)