熟眠膠囊對失眠模型大鼠腦內(nèi)不同組織5-HT1a、5-HT2a受體表達(dá)的影響

王冰梅1，許峰2，王中男2*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長春 130117)

摘要：目的觀察熟眠膠囊對失眠大鼠腦內(nèi)5-HT1a、5-HT2a受體表達(dá)的影響。方法將成年雄性Wistar大鼠60只隨機(jī)分為正常對照組(N組)、失眠模型組(M組)、地西泮組(D組)、熟眠膠囊高、中、低組(SM-H、SM-M、SM-L組),每組10只，采用腹腔注射PCPA法造模。造模成功后，給藥組分別給予熟眠膠囊(28，14，7 g/kg)、地西泮(0.525 mg/kg)，N組、M組給予相應(yīng)容量的蒸餾水，連續(xù)給藥7 d,分別觀察各組大鼠下丘腦、海馬內(nèi)5-HT1a、5-HT2a受體mRNA表達(dá)量的變化。結(jié)果與N組相比，M組下丘腦、海馬5-HT1a表達(dá)量明顯降低、5-HT2a表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05、P<0.05);與M組相比，D組下丘腦、海馬5-HT1a表達(dá)量明顯升高、5-HT2a表達(dá)量明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05、P<0.05)；與M組相比，SM-H、SM-M組下丘腦、海馬5-HT1a表達(dá)量明顯升高(P<0.05、P<0.05)、5-HT2a表達(dá)量明顯降低(P<0.05、P<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論熟眠膠囊可以通過調(diào)節(jié)失眠模型大鼠下丘腦、海馬中5-HT1a、5-HT2amRNA的表達(dá)發(fā)揮治療作用。

關(guān)鍵詞：熟眠膠囊；失眠；5-羥色胺1a受體；5-羥色胺2a受體

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.03.022

中圖分類號：R256.23文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)03-0286-03

基金項目:吉林省科學(xué)技術(shù)廳課題(20110930)。

作者簡介:王冰梅(1970-)，女，博士，副教授，主要從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。

收稿日期:(責(zé)任編輯：張瑞彬2014-02-10)

*通信作者:王中男，電話-(0431)86172503，電子信箱-zhongnanw@sina.com

Effects of Shu-Mian Capsule on 5-HT1a、5-HT2areceptor mRNA expression of

different brain tissue of insomnia rat

WANG Binmei1,XU Feng2,WANG Zhongnan2*

(1.Department of Physiology,College of Basic Medical,Changchun University of TCM,Changchun 130117,China;

2.First Affiliated Hospital of Changchun University of TCM,Changchun 130117,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the effect of Shu-Mian Capsule on the expression of 5-HT1a and 5-HT2a receptors in Insomnia rats’ brain.MethodsSixty male Wistar rats were randomly divided into control (N group),insomnia model (M group),Diazepam (D group),and high,middle and low dose group of Shu-Mian Capsule groups(SM-H、SM-M、SM-L group respectively),with 10 cases in each,and the insomnia model rats were made by intraperitoneal injection of PCPA.The rats of SM-H、SM-M、SM-L group were subsequently administrated with Shu-Mian Capsule at a dose of 28 g/kg,14 g/kg,7 g/kg respectively,while rats in D group with Diazepam at a dose of 0.525 mg/kg,and rats in M and N groups with the same volume of distilled water.The treatment lasted for 7 days.Then the expression of 5-HT1a and 5-HT2a receptors mRNA in hypothalamus and hippocampus in each rat were investigated.ResultsCompared with the control (N) group,the expression of 5-HT1a mRNA in hypothalamus and hippocampus in rats from M group decreased significantly,while the 5-HT2a mRNA increased significantly(P<0.05,P<0.05).Compared with M group,the expression of 5-HT1a mRNA in hypothalamus and hippocampus in rats from D group increased significantly,while the 5-HT2a mRNA decreased significantly (P<0.05,P<0.05).Compared with M group,the expression of 5-HT1a mRNA in hypothalamus and hippocampus in rats from SM-H and SM-M groups increased significantly,while the 5-HT2a mRNA decreased significantly (P<0.05,P<0.05).ConclusionThe therapeutic effect of Shu-Mian capsule maybe performed by the regulating of the expression of 5-HT1a and 5-HT2a mRNA in the insomnia model rats’ hypothalamus and hippocampus.

Keywords:Shu-Mian Capsule;Insomnia;serotonin 1a receptor;serotonin 2a receptor

失眠可引起人或動物出現(xiàn)疲勞、思維紊亂，常伴不良的情緒變化。5-羥色胺(5-HT)是睡眠調(diào)節(jié)最為重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，腦組織內(nèi)5-HT1a、5-HT2a受體mRNA的表達(dá)量可以反映5-HT對睡眠的調(diào)節(jié)機(jī)制。熟眠膠囊在臨床上治療失眠癥療效確切。本實驗通過研究熟眠膠囊對失眠模型大鼠下丘腦、海馬內(nèi)5-HT1a、5-HT2a受體mRNA的表達(dá)量的影響，探討其改善睡眠的作用機(jī)制。

1實驗材料

1.1實驗動物成年雄性Wistar大鼠60只，購自吉林大學(xué)實驗動物中心，合格證號2013A015，體質(zhì)量180～220 g。動物于實驗前1周適應(yīng)環(huán)境，自由進(jìn)食、飲水。

1.2實驗儀器和試劑臺式高速冷凍離心機(jī)(LECEND MICRO 21R)，Thermo；7500實時熒光定量PCR，美國ABI；PCPA，美國Sigma公司；柱式Trizol總RNA提取試劑盒，上海生工公司；TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒，北京全式金公司；PCR引物合成，上海生工公司。

1.3藥物熟眠膠囊，由長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供；地西泮，江蘇濟(jì)川制藥有限公司生產(chǎn)。

2實驗方法

2.1分組及造模將Wistar大鼠隨機(jī)分組為正常組(N組)和實驗組,正常組10只，實驗組若干只。實驗組大鼠腹腔注射對氯苯丙氨酸(PCPA)(300 mg/kg)，連續(xù)2 d，1次/d，正常組每日注射生理鹽水。于第1次注射PCPA 48 h后應(yīng)用閾劑量戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進(jìn)行睡眠實驗，以大鼠睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時間為指標(biāo)，評價造模成功與否。取模型制備成功的實驗組大鼠50只，隨機(jī)分為5組,分別為失眠模型組(M組)、地西泮組(D組)、熟眠膠囊高、中、低組(SM-H、SM-M、SM-L組)，每組10只。

2.2給藥N組、M組大鼠灌胃生理鹽水2 mL，1次/d；D組灌胃地西泮0.525 mg/kg，1次/d；SM-H、SM-M、SM-L組灌胃熟眠膠囊(28，14，7 g/kg)，給藥劑量按動物與人體每千克體質(zhì)量計量折算系數(shù)換算,系數(shù)為6.25[1]，1次/d,連續(xù)給藥7 d。

2.3實時熒光定量PCR檢測下丘腦、海馬5-HT1a、5-HT2a受體mRNA的表達(dá) 于末次給藥2 h后，各組動物在冰臺上斷頭取下丘腦、海馬組織，放入液氮中速凍，置于-80 ℃冰箱保存。所有試驗器材都經(jīng)滅活RNA酶處理。采用柱式Trizol總RNA提取試劑盒提取大鼠下丘腦、海馬組織標(biāo)本中的總RNA；TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后測定下丘腦、海馬中的5-HT1a、5-HT2a受體mRNA的表達(dá)量。

以GAPDH作內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析大鼠下丘腦、海馬5-HT1a、5-HT2a受體的基因相對表達(dá)量。2-ΔΔCt法相對定量分析結(jié)果判定：循環(huán)閾值(ΔCt)=Ct樣品均值-Ct內(nèi)參均值，ΔΔCt=ΔCt-(Ct陰性對照樣品均值-Ct內(nèi)參均值)。

實驗熒光定量PCR檢測引物為:GAPDH上游引物5’-acatgccgcctggagaaacct-3’，下游引物5’-gcccaggatgccctttagtgg-3’；5-HT1a上游引物5’-ccgcacgcttccgaatcc-3’，下游引物5’-tgtccg ttcaggctcttcttg-3’；5-HT2a上游引物5’-aacggtccatccacagag-3’，下游引物5’-aacaggaagaacacg atgc-3’。PCR擴(kuò)增條件為:95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃20 s，72 ℃30 s，共40個循環(huán)。

3實驗結(jié)果

3.1熟眠膠囊對失眠模型大鼠下丘腦、海馬組織5-HT1amRNA表達(dá)量的影響給藥結(jié)束后，各組大鼠下丘腦、海馬組織5-HT1amRNA的相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與M組比較,SM-H組下丘腦、海馬組織5-HT1amRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01,P<0.01)；SM-M下丘腦、海馬組織5-HT1amRNA表達(dá)水平升高(P<0.05，P<0.05)；SM-L組下丘腦、海馬組織5-HT1amRNA表達(dá)水平的升高無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,P>0.05)；SM-H組與D組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。上述結(jié)果表明，熟眠膠囊可提高下丘腦、海馬組織中的5-HT1amRNA的表達(dá)，與地西泮藥效相近。結(jié)果見表1。

組 別下丘腦海馬N組0.93±0.10 0.71±0.07 M組0.68±0.09 0.45±0.06 SM-H組0.82±0.08##△0.56±0.07##△SM-M組0.78±0.04# 0.53±0.07# SM-L組0.75±0.08 0.51±0.06 D組0.88±0.08## 0.63±0.06#

注：與M組相比#P<0.05；與M組比較##P<0.01；與D組比較△P>0.05

3.2熟眠膠囊對失眠模型大鼠下丘腦、海馬組織5-HT2amRNA表達(dá)量的影響給藥結(jié)束后，各組大鼠下丘腦、海馬組織5-HT2amRNA的相對表達(dá)量存在統(tǒng)計學(xué)差異。與M組比較，SM-H組下丘腦、海馬組織5-HT2amRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01，P<0.05)；SM-M下丘腦、海馬組織5-HT2amRNA表達(dá)水平降低(P<0.05，P<0.05)；SM-L組下丘腦、海馬組織5-HT2amRNA表達(dá)水平的降低無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，P>0.05)；SM-H組與D組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。上述結(jié)果表明，熟眠膠囊可降低下丘腦、海馬組織中的5-HT1amRNA的表達(dá)，與地西泮藥效相近。結(jié)果見表2。

組 別下丘腦海馬N組0.69±0.09 0.35±0.12 M組0.90±0.07 0.71±0.10 SM-H組0.75±0.08##△0.54±0.11# SM-M組0.79±0.06# 0.56±0.10# SM-L組0.83±0.07 0.63±0.10 D組0.68±0.09## 0.41±0.11##

注：與模型組相比#P<0.05；與模型組比較##P<0.01；與安定組比較△P>0.05

4討論

熟眠膠囊是王中男教授的多年臨床驗方，該方以歸脾湯為基礎(chǔ)，由人參、麥冬、當(dāng)歸、酸棗仁、五味子等中藥組成，在臨床上取得了良好的療效。歸脾湯治療失眠在臨床上多有報道，孫紹華等[2]應(yīng)用加味歸脾湯治療失眠癥50例，葉人等[3]應(yīng)用歸脾湯結(jié)合睡眠衛(wèi)生宣教對心脾兩虛型亞健康失眠患者進(jìn)行干預(yù),本科室[4]也報道了歸脾熟眠湯治療心脾兩虛證失眠患者32例，均取得了良好的臨床效果，但對其治療失眠的作用機(jī)制尚未見研究報道。

5-HT能系統(tǒng)的功能涉及抑郁、損傷性應(yīng)激、睡眠以及覺醒的調(diào)節(jié)等，其在觸發(fā)和維持睡眠中起重要作用。5-HT合成抑制劑對氯苯丙氨酸(PCPA)可拮抗5-HT前體5HTP來引起失眠，腹腔注射PCPA引起的大鼠失眠是公認(rèn)的動物失眠模型，肖成榮等[5]報道，PCPA連續(xù)給藥2 d，第3天時大鼠下丘腦、海馬組織中5-HT含量均降低；第7天大鼠的睡眠和自發(fā)活動都會迅速恢復(fù)到正常水平，而其腦中的5-HT含量仍低于正常水平的50%。

5-HT受體分為7個類型(5-HT1-7)，每個類型又分為多種亞型,在抗失眠研究最受到關(guān)注是5-HT1a和5-HT2a受體。研究表明5HT1a受體激動藥具有減少快速動眼睡眠(REM)、增加REM潛伏期、升高腦內(nèi)5HT含量的作用[6]。 研究表明[7]選擇性5-HT2a受體拮抗劑可增加慢波睡眠(SWS)和非快速動眼睡眠(NREM)，減少覺醒次數(shù)且無對于REM的影響，因此認(rèn)為5-HT2a受體拮抗藥物是治療失眠的比較理想藥物。

熟眠膠囊可提高下丘腦及海馬內(nèi)5-HT1a受體mRNA含量，降低5-HT2a受體mRNA含量，提示熟眠膠囊可能是通過影響下丘腦及海馬內(nèi)5-HT1a、5-HT2a受體表達(dá)調(diào)節(jié)下丘腦及紋狀體內(nèi)5-HT能系統(tǒng)的作用，從而起到治療失眠的作用。

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