基于病理學(xué)評價(jià)淫羊藿女貞子對激素干預(yù)哮喘大鼠的影響

年宏蕾,劉仁慧*,許利平,楊燕,王秀娟*

(首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

摘要：目的基于病理學(xué)評價(jià)研究藥對淫羊藿女貞子對激素干預(yù)哮喘大鼠的影響。方法卵蛋白致大鼠慢性哮喘模型后，腹腔注射地塞米松模擬激素干預(yù)過程，在激素應(yīng)用同時(shí)及撤停時(shí)合用中藥淫羊藿女貞子，觀察對肺組織病理、血及肺泡灌洗液(BALF)涂片嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)數(shù)量的影響。結(jié)果激素干預(yù)組、淫羊藿女貞子合激素Ⅰ、Ⅱ組顯著改善肺組織支氣管黏膜上皮脫落、管腔阻塞程度(分別為0.391±0.200，0.429±0.200，0.429±0.200，P均<0.05)，降低BALF中EOS數(shù)量(分別為8.30±2.06，9.70±2.45，10.60±2.32，P<0.05或0.01)及肺組織總管壁厚度(分別為106.26±14.00，95.73±14.78，87.47±14.44，P均<0.01)；激素干預(yù)組、淫羊藿女貞子合激素干預(yù)Ⅰ組顯著抑制血EOS數(shù)量(分別為5.30±2.31，5.50±1.51，P均<0.01)，改善肺組織EOS浸潤(分別為0.420±0.200，0.348±0.200，P均<0.05)；淫羊藿女貞子合激素Ⅰ組可顯著降低肺組織平滑肌厚度(16.46±4.17，P<0.05)。結(jié)論激素應(yīng)用同時(shí)配伍淫羊藿女貞子可增強(qiáng)協(xié)同抗炎作用及抑制哮喘氣道重塑的作用。

關(guān)鍵詞：糖皮質(zhì)激素；淫羊藿；女貞子；氣道炎癥；氣道重塑；大鼠

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.08.022

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)08-0826-04

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373814)；北京中醫(yī)藥薪火傳承“3+3”工程二室一站建設(shè)項(xiàng)目(2012-SZ-C-42)；北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進(jìn)與培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(SIT&TCD201504097)。

作者簡介:年宏蕾(1991-)，女，碩士研究生，主要從事中藥及復(fù)方的藥效及作用機(jī)制研究。

收稿日期:(責(zé)任編輯：趙玉芝2014-09-04)

*通信作者:劉仁慧，電話-(010)83911639，電子信箱-liurenhui995@163.com

王秀娟，電話-(010)83911624，電子信箱-wxj0517@sina.com

HerbaEpimediiandFructusLigustrilucidion pathology evaluationin

asthmatic rats with hormone intervention

NIAN Honglei,LIU Renhui*,XU Liping,YANG Yan,WANG Xiujuan*

(School of Traditional Chinese Medicine,Capital Medical University;

Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Collateral Disease Theory Research,Beijing 100069,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of the combination of Herba Epimedii,Fructus Ligustrilucidi and glucocorticoids(GC) on the pathology change in the asthmatic rats.MethodsRat asthmatic model was established by sensitization and challenge with ovalbumin(OVA).Dexamethasone was injected into asthmatic rats with the oral gavage of Epimedium and Ligustrumlucidum at different treatment stage of GC withdraw.The pathological changes of lung tissue and the eosinophils (EOS) number in the branchoalveolar lavage fluids(BALF) and blood were observed.ResultsThe GC group and the first and second groups of the combination of Herba Epimedii,Fructus Ligustrilucidi and GC alleviated bronchial mucosa epithelial shedding and lumenobstruction (0.391±0.200,0.429±0.200,0.4290±0.200,P<0.05),reduced the EOS number in BALF (8.30±2.06,9.70±2.45,10.60±2.32,P<0.05 or 0.01),and decreased the total bronchial wall area in the lung tissue (106.26±14.00,95.73±14.78,87.47±14.44,P<0.01).The GC group and the first group of the combination of Herba Epimedii,Fructus Ligustrilucidi and GC reducedthe EOS number inthe blood (5.30±2.31,5.50±1.51,P<0.01) and the EOS infiltration in the lung tissue (0.42±0.200,0.348±0.200,P<0.05).The first group of the combination of Herba Epimedii,Fructus Ligustrilucidi and GC can reduce the smooth musche area in the lung tissue (16.46±4.17,P<0.05).ConclusionsThe combination of Herba Epimedii,Fructus Ligustrilucidi and GC hasbetter anti-inflammatory effects on the asthmatic model of rats,and play a protective role in inhibiting airway remodeling.

Keywords:asthma;glucocorticoids;Herba Epimedii;FructusLigustri Lucidi;airway inflammation;airway remodeling;rat

哮喘是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅公眾健康的一種常見慢性病[1]，目前針對哮喘發(fā)病機(jī)制中氣道炎癥學(xué)說，糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids,GC)被認(rèn)為是防治哮喘的首選藥物，但能否有效抑制氣道重塑尚存在爭議[1-2]，且實(shí)踐中使用GC也存在諸多不良反應(yīng)[3]?，F(xiàn)代學(xué)者認(rèn)為，外源性超生理劑量的GC類同于“壯火”，發(fā)越腎氣、腎精，致火旺陰傷，日久累及腎陽，最終形成陰陽兩虧[4-5]，防治GC的不良反應(yīng)當(dāng)以補(bǔ)腎中陰陽為基本立法。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，平補(bǔ)腎中陰陽的藥對淫羊藿女貞子能夠協(xié)同激素抗炎，并拮抗激素不良反應(yīng)[6-8]。本研究通過觀察與氣道炎癥、氣道重塑相關(guān)的病理學(xué)改變，評價(jià)藥對協(xié)同激素治療哮喘的療效。

1材料

SPF級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(120±10) g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK(京)2007-0001。402A超聲霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司)；NIS-Elements BR 3.2圖像分析軟件、尼康(Nikon)ECLIPSE 80i生物顯微鏡(北京銳馳恒業(yè)儀器科技有限公司);萊卡2016型切片機(jī)(上海萊卡儀器有限公司)。女貞子、淫羊藿中藥材均購自北京同仁堂藥店；卵清白蛋白(OVA)、氫氧化鋁凝膠(美國Sigma公司)；地塞米松磷酸鈉注射液(天津藥業(yè)焦作有限公司，批號10081711)。

2方法

2.1動物分組篩選合格動物60只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，即正常對照組(1組)、哮喘模型組(2組)、激素干預(yù)組(3組)，淫羊藿女貞子組(4組)，淫羊藿女貞子合激素干預(yù)Ⅰ組(5組)、合激素干預(yù)Ⅱ組(6組)，每組10只。

參考文獻(xiàn)2.2造模及給藥方法[9]于實(shí)驗(yàn)1～35 d，除正常對照組外，其余動物全部造模。在普通哮喘模型制備成功的基礎(chǔ)上，各造模組均每周2次給予1%OVA霧化吸入直至結(jié)束。實(shí)驗(yàn)36～49 d(激素撤停前階段)，3、5、6組腹腔注射地塞米松注射液0.5 mg/kg，1次/d；實(shí)驗(yàn)50～77 d(激素撤停中階段)，每周遞減腹腔注射地塞米松0.1 mg/kg。4組在哮喘模型處理的基礎(chǔ)上，于實(shí)驗(yàn)36 d分別開始灌胃淫羊藿女貞子水溶液(9.5 g/kg)；5、6組在相應(yīng)GC組處理的基礎(chǔ)上,分別于實(shí)驗(yàn)36、50 d開始給予淫羊藿女貞子水溶液(9.5 g/kg)。

2.3標(biāo)本采集與檢測78 d處死動物，尾部取血作血涂片；開胸，取肺組織連同氣管，結(jié)扎左主支氣管，剪取左肺；右肺行支氣管肺泡灌洗術(shù)，回收支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，分離BALF沉淀涂片。血及BALF涂片作瑞氏染色，記錄嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophils，EOS)數(shù)目。左肺行肺組織HE染色，行氣道炎癥半定量分析[10];計(jì)算支氣管基底膜周徑(Pbm)、標(biāo)準(zhǔn)化氣道總管壁厚度(Wat)及標(biāo)準(zhǔn)化平滑肌厚度(Wam)[11],基于各組動物之間Pbm差異顯著(P<0.01)，采取Pbm、Wat及Wam值除以相應(yīng)動物體質(zhì)量(kg)為最終標(biāo)準(zhǔn)化值，評價(jià)對氣道重塑的影響作用。

3結(jié)果

3.1各組大鼠血及BALF涂片EOS計(jì)數(shù)的比較見表1。

表1　各組大鼠血及BALF涂片EOS計(jì)數(shù)的比較

注：與1組比較，##P<0.01；與2組比較，△P<0.05，△△P<0.01

3.2各組大鼠肺組織病理學(xué)半定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2～5，圖1。2組支氣管黏膜上皮水腫、增生程度，支氣管黏膜上皮脫落、管腔阻塞程度，支氣管壁炎性細(xì)胞浸潤程度,EOS增多程度較1組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與2組比較，3、5、6組支氣管黏膜上皮脫落、管腔阻塞程度有顯著改善；3、5組能抑制肺組織EOS浸潤。

表2　各組大鼠支氣管黏膜上皮水腫、增生程度的比較 ± s, n=8)

表3　各組大鼠支氣管黏膜上皮脫落、管腔阻塞程度的比較 ± s, n=8)

表4　各組大鼠支氣管壁炎性細(xì)胞浸潤程度的比較 ± s, n=8)

表5　各組大鼠EOS浸潤程度的比較

注：1)與1組比較，#P<0.05；與2組比較，△P<0.05。2)半定量采用Ridit分析法，以合計(jì)數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)組計(jì)算。3)平均級數(shù)計(jì)算是將各分級分別計(jì)分為0、1、2、3，計(jì)算平均分。

圖1　支氣管肺組織HE染色照片(×200)

3.3各組大鼠支氣管壁總厚度和平滑肌厚度的比較見表6。各組之間Pbm值無顯著差異。與1組比較，2組Wat值、Wam值均顯著增高(P<0.05或0.01)；與2組比較，3、5、6組可顯著降低Wat值(P<0.01)；5組可顯著降低Wam值(P<0.05)；與3組比較，各給藥組均可顯著降低Wam值(P<0.05或0.01)。

組 別Pbm(μm/kg)Wat/〔μm2/(μm·kg)〕Wam/〔μm2/(μm·kg)〕1組2617±245117.24±13.41 15.53±2.29 2組2810±244141.61±26.21# 22.02±6.14## 3組2535±253106.26±14.00△△24.75±3.18 4組2778±206144.12±27.23 20.29±4.62 5組2580±38995.73±14.78△△16.46±4.17△▲▲6組2567±45387.47±14.44△△19.07±4.97▲

注：與1組比較，#P<0.05，##P<0.01；與2組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與3組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

4討論

慢性氣道炎癥是哮喘產(chǎn)生的病理基礎(chǔ),以氣道內(nèi)大量EOS浸潤為主；氣道重塑是哮喘發(fā)生和發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，是慢性炎癥反復(fù)損傷和修復(fù)的結(jié)果，導(dǎo)致不可逆性氣流阻塞和增加氣流阻力，同時(shí)還加重氣道高反應(yīng)性[12-13]，是頑固性哮喘的主要原因之一[14]。哮喘的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以組織學(xué)病理改變?yōu)橹?，基本的病理改變包括慢性剝脫性嗜酸?xì)胞性支氣管炎及氣道重建[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，哮喘大鼠肺組織中支氣管黏膜上皮水腫、增生，支氣管黏膜上皮脫落、管腔阻塞，伴炎性細(xì)胞浸潤，且支氣管壁Wat值、Wam值均顯著增高，血及BALF中EOS數(shù)量升高，提示哮喘大鼠存在以EOS增高為主要特征的氣道炎癥改變及氣管壁、平滑肌增厚為評價(jià)指標(biāo)的氣道重塑。經(jīng)藥物治療后，激素組對肺組織支氣管黏膜上皮脫落、管腔阻塞程度有顯著改善，并顯著降低血及BALF中EOS數(shù)量;淫羊藿女貞子合激素Ⅰ組顯著緩解肺組織支氣管黏膜上皮脫落、管腔阻塞程度，降低血及BALF中EOS,并可顯著降低Wat值及Wam值；淫羊藿女貞子合激素Ⅱ組對肺組織支氣管黏膜上皮脫落、管腔阻塞程度有改善，并降低BALF中EOS數(shù)量及支氣管壁Wat值。提示地塞米松對哮喘氣道炎癥有明顯的改善作用，但對氣道重塑沒有明顯的作用；淫羊藿女貞子協(xié)同激素共用，對哮喘的氣道炎癥及氣道重塑均有顯著改善作用,且淫羊藿女貞子合激素干預(yù)Ⅰ組抑制Wam的作用更優(yōu)，提示中藥淫羊藿女貞子在激素應(yīng)用早期介入，不僅可協(xié)同激素抗炎，并可抑制哮喘的氣道重塑的病理改變。

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