通蓮湯對(duì)裸小鼠胃癌移植瘤生長(zhǎng)及缺氧誘導(dǎo)因子-1α的影響

張艷麗1，賈永森2，秦麗娟3，孫瑞軍3

(1.遷安燕山醫(yī)院，河北 遷安 064400；2.河北聯(lián)合大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000；

3.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000)

摘要：目的探討復(fù)方通蓮湯對(duì)胃癌MGC803細(xì)胞荷瘤裸鼠的抑瘤作用及對(duì)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)表達(dá)的影響,為該方臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法胃癌細(xì)胞株MGC803接種于裸鼠右前肢皮下。模型組灌胃生理鹽水溶液10 mL/kg，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃消癌平片1.8 g(生藥量)/kg的藥液10 mL/kg, 復(fù)方通蓮湯高、中、低劑量組分別灌胃1.5，0.75，0.375 g(生藥量)/L的藥液10 mL/kg，各組連續(xù)給藥3周，再連續(xù)觀察3周,6周后處死小鼠，分離瘤組織，計(jì)算抑瘤率，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織HIF-1α表達(dá)。結(jié)果高劑量通蓮湯顯著抑瘤生長(zhǎng)，瘤重(1.51±0.49) g，抑瘤率為(61.04±4.79)%，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；通蓮湯可顯著抑制HIF-1α表達(dá)，與模型組比較，陽(yáng)性表達(dá)率χ2=4.286，P=0.038<0.05。結(jié)論通蓮湯可抑制裸鼠人胃癌MGC803細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)，其抑瘤機(jī)制與下調(diào)腫瘤細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：通蓮湯；胃癌；MGC803細(xì)胞；荷瘤裸鼠；缺氧誘導(dǎo)因子-1α

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.08.025

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1003-5699(2015)08-0837-04

基金項(xiàng)目:河北省自然科學(xué)基金(H2013209053)。

作者簡(jiǎn)介:張艷麗(1980-)，女，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)內(nèi)科學(xué)研究。

收稿日期:(責(zé)任編輯：趙玉芝2014-10-08)

*通信作者:賈永森，電子信箱-jysen@163.com

Tonglian Decoction on tumor growth and HIF-1α expression of tumor tissue

from nude mice modeled with gastric cancer cells

ZHANG Yanli1,JIA Yongsen2,QIN Lijuan3,SUN Ruijun3

(1.Yanshan Hospital of Qian’an,Qian’an,064400,Hebei Province,China;

2.Traditional Chinese Medicine College,Hebei United University,Tangshan 063000,Hebei Province,China;

3.School of Basic Medicine,Hebei United University,Tangshan 063000,Hebei Province,China)

Abstract:ObjectiveThe purpose of the research is to observe inhibition of Tonglian Decoction (TD) on nude mice modeled with gastric cancer cells MGC-803 and on hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) expression in tumor tissue,to provide experimental basis for clinical application of TD.MethodsMGC-803 cells are inoculated subcutaneously in right forelimbs of all mice.Mice in model group are treated with saline solution 10 mL/kg orally.Mice in positive control group are treated with Xiaoaiping tablet,dosage of 10 mL/kg,1.8 g/kg (crude drug) of liquid.Mice in TD groups are subdivided as high (1.5 g/L),medium (0.75 g/L) and low (0.375 g/L) dose group of drug liquid,with dosage of 10 mL/kg.All mice take administration for 3 weeks and are observed for another 3 weeks continuously.Tumor volumes are measured for 6 weeks everyday from the beginning of MGC803 cells transplanted.All mice are killed for isolation of tumor tissue,inhibition ratio of tumor-weight measured.Finally,HIF-1α expression is examined with immunohistochemistry.ResultsTumor weight in TD high-dose group is (1.51±0.49) g,and the inhibition ratio is (61.04±4.79)%,which is significantly different from that in the model group (P<0.05);Positive rate of HIF-1α expression also decreased significantly,showing statistical difference from the model group (χ2=4.286,P=0.038<0.05).ConclusionTD inhibits tumor growth on nude mice modeled with MGC803,through downregulation of HIF-1α protein expression.

Keywords:Tonglian Decoction;gastric cancer;MGC803 cells;nude mice transplanted with tumor;HIF-1α

胃癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，雖然綜合治療使得胃癌5年生存率有所提高,但患者預(yù)后效果仍然較差[1]。研究表明[2]，血管生成與胃癌發(fā)生及發(fā)展有密切的關(guān)系,缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)過(guò)度表達(dá)是促使腫瘤細(xì)胞生成、增殖的重要因素之一[3]。HIF-1α作為新近發(fā)現(xiàn)的促血管生長(zhǎng)因子,可為抗血管生成治療提供新的作用機(jī)制研究。

中醫(yī)藥治療胃癌具有優(yōu)勢(shì),表現(xiàn)在個(gè)體化、多靶點(diǎn)控制腫瘤生長(zhǎng)[4]。根據(jù)該病中醫(yī)基本病機(jī)，在“通幽湯”(《脾胃論》)基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代中藥藥理研究成果，自擬“通蓮湯”以益氣活血、解毒散結(jié)，獲得國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利[5]。體外實(shí)驗(yàn)研究表明,該方可顯著抑制胃癌MGC803細(xì)胞增殖[6],其抑癌機(jī)制與下調(diào)NF-κB信號(hào)通路IKKβ和NF-κB蛋白有關(guān)[7]。本研究通過(guò)荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步觀察了通蓮湯對(duì)胃癌瘤體的抑制作用以及對(duì)HIF-1α的影響，以豐富該方防治胃癌的分子機(jī)制。

1材料

4～5周齡裸鼠(BALBc nu/nu)，雌、雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，合格證號(hào):SCXK(京)2009-0017；裸鼠在層流架內(nèi)飼養(yǎng)，恒溫22～25 ℃、恒濕(55±5)%，所有食物和水均滅菌后使用。MGC803人胃癌細(xì)胞株，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心提供。通蓮湯(生地黃、當(dāng)歸、升麻、檳榔、通關(guān)藤、半枝蓮、白花蛇舌草等)，各單味藥物均購(gòu)于北京同仁堂唐山連鎖藥店有限公司，提取液含生藥材1.5 g/mL。消癌平片，批號(hào)110706，南京圣和制藥有限公司。鼠抗人HIF-1α抗體(28 b,Santa Cruz生物科技公司)，新生小牛血清(GIBCO公司)，DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)，胰蛋白酶(GIBCO公司)；MTT(Amresco公司)，DMSO(Amresco公司)。1100型無(wú)菌超凈臺(tái)(FORMA公司)，NOVAPATH 450酶標(biāo)光度計(jì)(Bio-Tek公司)，3336 CO2培養(yǎng)箱(FORMA公司)，TMD-2倒置式顯微鏡(NIKON公司)，3MK型低溫高速離心機(jī)(SIGMA公司)，JJ-2型組織勻漿機(jī)(Waring公司)。

2方法

2.1方藥配制各味中藥以紗布過(guò)濾掉藥物雜質(zhì)，并加入30倍體積超純水，浸泡30 min，100 ℃溫浸6 h，4層醫(yī)用紗布過(guò)濾，收集藥液，入燒杯中濃縮至200 mL，冷卻至室溫，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min 2次，吸取藥液上清，0.22 μm濾器濾過(guò)后，加熱濃縮收膏，計(jì)算提取物濃度，以生理鹽水(NS)配至10 mg/mL，1.5 mL離心管分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2細(xì)胞培養(yǎng)以10%小牛血清DMEM培養(yǎng)液8 mL，接種MGC803細(xì)胞于Φ100 mm培養(yǎng)皿中,置于37 ℃，5%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱孵育。

2.3分組及給藥裸小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只,分別為模型對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照藥(消癌平)組，通蓮湯高、中、低劑量組。將MGC803細(xì)胞傳代至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化離心，計(jì)數(shù)，以1×107/mL的濃度接種于裸鼠右前肢皮下。模型對(duì)照組灌胃NS10 mL/kg;陽(yáng)性藥組灌胃消癌平片水溶液(生藥量)1.8 g/kg，通蓮湯高、中、低劑量組(生藥量，下同)分別灌胃1.5，0.75，0.375 g/L的藥液(以NS配成)，消癌平、通蓮湯給藥量均為10 mL/kg。各組均連續(xù)給藥3周，后續(xù)觀察3周后，裸鼠脫臼處死。

2.4檢測(cè)指標(biāo)

2.4.1計(jì)算抑瘤率裸鼠處死后，取腫瘤組織皮下完整剝?nèi)∧[瘤組織，剔除纖維包膜,于電子天平上稱(chēng)取瘤重，計(jì)算抑瘤率[8]。抑瘤率=〔(模型組平均瘤重-處理組平均瘤重)/模型組平均瘤重〕×100%

2.4.2形態(tài)學(xué)觀察取部分剝離的瘤組織以10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋、制成4 μm厚的切片、HE染色、光鏡下觀察瘤組織細(xì)胞形態(tài)[9]。

2.4.3免疫組化法測(cè)定HIF-1α用40 g/L甲醛固定瘤塊,石蠟包埋、切片。免疫組織化學(xué)法步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，所有切片均在同一光強(qiáng)度，同一放大倍數(shù)下進(jìn)行圖像分析，染色陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色顆粒狀，位于細(xì)胞核內(nèi)，只要有明確陽(yáng)性產(chǎn)物即作為陽(yáng)性細(xì)胞。表達(dá)率測(cè)定:每例標(biāo)本在400倍光鏡下，隨機(jī)計(jì)數(shù)20個(gè)視野，記錄每個(gè)視野的陽(yáng)性表達(dá)率(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/全視野細(xì)胞數(shù))，取其均數(shù)作為每例樣本陽(yáng)性表達(dá)率的評(píng)定依據(jù)。所占比率為0～5%為陰性(-),5%～25%為弱陽(yáng)性(+)，25%～50%為中度陽(yáng)性(++)，50%以上為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)[10]。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差別顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1各藥抑瘤率模型組和通蓮湯中、低劑量組裸鼠瘤體重量較大；消癌平組，通蓮湯高劑量組瘤重較小。通蓮湯高劑量組、消癌平組與模型組相比，有顯著性差異(P<0.05),兩者抑瘤率均達(dá)到60%以上；通蓮湯高劑量組與消癌平組作用相當(dāng)。如表1。

表1　各組瘤體平均瘤重及抑瘤率 ± s)

注：與模型組比較，#P<0.05

3.2皮下移植瘤組織形態(tài)學(xué)觀察模型組瘤組織內(nèi)瘤細(xì)胞核大畸形、核仁深染，腺體擁擠，血竇豐富；通蓮湯高劑量組、消癌平組的腫瘤細(xì)胞呈圓形或橢圓形，淡染，核分裂少見(jiàn)，可見(jiàn)較多腫瘤細(xì)胞腫脹變性壞死；間質(zhì)中的淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯升高。通蓮湯中、低劑量組細(xì)胞多數(shù)深染，可見(jiàn)小片狀壞死區(qū)，與模型組相似。如圖1。

3.3皮下移植瘤組織中HIF-1α蛋白的表達(dá)模型組、通蓮湯中、低劑量組瘤體HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)顯著性差異；通蓮湯高劑量組、消癌平組HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率與模型組相比均有顯著性差異(P<0.05)，其中，通蓮湯高劑量組與模型組比較陽(yáng)性表達(dá)率χ2=4.286，P=0.038<0.05，說(shuō)明通蓮湯高劑量組均有較好穩(wěn)定下調(diào)HIF-1α表達(dá)的作用。如圖2和表2。

表2　各組荷瘤裸鼠瘤體組織HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)

注：與模型組比較，#P<0.05

圖1　皮下移植瘤組織形態(tài)學(xué)病理切片(×100)

圖2　各組癌組織HIF-1α表達(dá)(×100)

4討論

通蓮湯是依據(jù)“金元四大家”之一李東垣所創(chuàng)“通幽湯”加味化裁而來(lái)[11]，專(zhuān)為胃癌氣陰虧虛、瘀血內(nèi)結(jié)而設(shè)。鑒于該復(fù)方組成藥物均為天然中藥材，實(shí)驗(yàn)中選擇同為中藥屬性的烏骨藤有效提取物——消癌平作為陽(yáng)性對(duì)照藥，許多基礎(chǔ)和臨床研究表明，其對(duì)胃癌具有確切療效[12-13]。

本研究采用源于臨床患者的人胃癌MGC803細(xì)胞，裸鼠皮下移植成瘤，觀察通蓮湯的抗癌作用。抑瘤率結(jié)果提示，通蓮湯高劑量組、消癌平組抑瘤明顯，抑瘤率達(dá)到60%左右,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，通蓮湯中、低劑量組抑瘤率維持在20%～40%，與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明，高劑量通蓮湯抑瘤生長(zhǎng)作用較顯著。

組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，通蓮湯高劑量組、消癌平組與模型組相比，瘤體組織結(jié)構(gòu)改變較明顯，瘤組織內(nèi)有大片壞死區(qū)，表明兩藥對(duì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，與抑瘤率測(cè)定結(jié)果一致。

惡性腫瘤快速生長(zhǎng)使腫瘤細(xì)胞處于缺氧微環(huán)境中，胞內(nèi)高表達(dá)的HIF-1α是主要的氧調(diào)節(jié)亞基，可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞適應(yīng)低氧狀態(tài)[14]，誘導(dǎo)多個(gè)相關(guān)基因表達(dá)[15-16]，促進(jìn)腫瘤血管生成[17]，從而促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[18]。本研究通過(guò)免疫組化研究顯示，高劑量的通蓮湯、對(duì)照藥消癌平可顯著抑制癌組織HIF-1α的表達(dá)，與模型組比較有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)果提示，通蓮湯通過(guò)下調(diào)HIF-1α表達(dá)，從而抑制腫瘤血管生成。

綜上所述，通蓮湯有較好的抑制胃癌荷瘤裸小鼠瘤體生長(zhǎng)作用，其抑瘤作用機(jī)制與下調(diào)瘤體組織內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)有關(guān)。

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