七氟醚預(yù)處理對心臟瓣膜置換術(shù)患者血清cTnI、外周血單核細(xì)胞Nrf2表達(dá)的影響

孫雪梅，王瑞婷，賀克強(qiáng)，章蔚，柴小青，潘建輝

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安徽省立醫(yī)院，合肥230001)

摘要：目的觀察七氟醚預(yù)處理對心肺轉(zhuǎn)流術(shù)(CPB)下心臟瓣膜置換術(shù)患者血清中cTnI和外周血單核細(xì)胞(PBMC)核蛋白Nrf2表達(dá)的影響，探討其對心肌的保護(hù)作用和機(jī)體氧化應(yīng)激的影響。 方法選擇擇期CPB下行心臟瓣膜置換術(shù)患者30例，隨機(jī)分為未吸入七氟醚對照組(C組)和七氟醚預(yù)處理組(S組)，每組15例。S組切皮至主動脈阻斷前吸入1.0%七氟醚20 min，隨后予以10 min洗脫期，如此重復(fù)2次。于麻醉誘導(dǎo)前(T1)、主動脈開放后2 h(T2)、24 h(T3)和48 h(T4)采集動脈血，檢測血清cTnI水平、MDA水平和SOD活性；于T1和T3用Western blotting檢測外周血PBMC核蛋白Nrf2表達(dá)水平；MDA水平、SOD活性與Nrf2蛋白表達(dá)水平進(jìn)行直線相關(guān)性分析。 結(jié)果與術(shù)前比較，T2～4時兩組血清中cTnI濃度均明顯升高(P均<0.05)，但S組明顯低于C組(P均<0.05)。與術(shù)前比較，T3時兩組PBMC核蛋白Nrf2表達(dá)均顯著升高(P均<0.05)，但S組明顯高于C組(P均<0.05)。與C組比較，T2～4時血清MDA水平降低，SOD活性升高(P<0.05)。MDA水平、SOD活性均與Nrf2蛋白表達(dá)具有相關(guān)性(r分別為-0.694、0.739，P均<0.05)。 結(jié)論 七氟醚預(yù)處理可以減輕CPB下心臟瓣膜置換術(shù)患者心肌損傷，減弱體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，以上作用可能與增強(qiáng)Nrf2蛋白的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：七氟醚；心肺轉(zhuǎn)流術(shù)；NF-E2相關(guān)因子2；心肌鈣蛋白I；氧化應(yīng)激

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.41.002

中圖分類號：R542.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)41-0004-03

基金項目：安徽省公益性技術(shù)應(yīng)用研究聯(lián)動計劃項目(1501ld04031)；安徽省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研課題資助項目(09A065)。

作者簡介：第一孫雪梅(1989-)，女，在讀碩士，主要從事心臟手術(shù)麻醉、吸入麻醉藥臨床應(yīng)用相關(guān)研究。 E-mail：18715519369@126.com 通信王瑞婷(1963-)，女，主任醫(yī)師，主要從事心臟手術(shù)臨床麻醉研究。E-mail:z80486@ah165.nct

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of sevoflurane preconditioning on serum cTnI and the nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2) expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of patients undergoing cardiac valve replacement with CPB, and to investigate its influence on the myocardial protection and oxidative stress of body. MethodsIn this randomized controlled trial, thirty patients who received valve replacement were randomly divided into two groups (n=15): the control group (group C) and sevoflurane preconditioning group (group S). In the group S, 1.0% sevoflurane was inhaled for 20 min from skin incision, and followed with oxygen elution for 10 min, it repeated twice. The artery blood samples were collected for the measurements of serum concentrations of cTnI, MDA and SOD immediately before anesthesia induction (T1), at 2 h (T2), 24 h (T3) and 48 h (T4) after aorta declamping respectively. The expression of Nrf2 protein from PBMC was detected by Western blotting at T1 and T3. Linear correlation between the expression of Nrf2 protein and MDA concentration, SOD activity was analyzed. ResultsCompared with that before operation, the concentration of serum cTnI was increased significantly in both groups(P<0.05) at T2-4. However, it was much lower in the group S than in the group C(P<0.05). The expression of Nrf2 protein in PBMC was increased significantly in both groups at T3 as compared with that before operation (P<0.05). However, it was much higher in the group S than in the group C (P<0.05). Compared with group C, the serum MDA concentration was decreased, while SOD activity was significantly higher at T2-4 in the group S (P<0.05). There was linear correlation between the expression of Nrf2 protein and MDA concentration, SOD activity (r=-0.694 and 0.739, all P<0.05). ConclusionSevoflurane preconditioning can alleviate myocardial injury and reduce oxidative stress injury in patients undergoing cardiac valve replacement with CPB, which might be associated with the increased Nrf2 expression.

收稿日期：(2015-09-09)

Effect of sevoflurane preconditioning on serum cTnI and Nrf2 expression in peripheral

blood mononuclear cells of patients undergoing cardiac valve replacement

SUNXue-mei,WANGRui-ting,HEKe-qiang,ZHANGWei,CHAIXiao-qing,PANJian-hui

(TheAffiliatedProvincialHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China)

Key words: sevoflurane; cardiopulmonary bypass; NF-E2-related factor 2; cardiac troponin I; oxidative stress

心臟停跳手術(shù)中心肌缺血再灌注損傷(MIRI)發(fā)生率較高[1]，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。MIRI與氧化應(yīng)激有關(guān)[2], 轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)是調(diào)控細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[3]，在心肌抗氧化中發(fā)揮重要作用[4]。動物實驗表明，七氟醚對鼠腦、心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與Nrf2表達(dá)增加有關(guān)[5，6]。2014年12月～2015年7月，本研究就七氟醚預(yù)處理對心臟瓣膜置換術(shù)患者血清中cTnI和單核細(xì)胞Nrf2表達(dá)以及體內(nèi)氧化應(yīng)激的影響進(jìn)行了觀察。

1資料與方法

1.1臨床資料 擇期擬在心肺轉(zhuǎn)流術(shù)(CPB)下行二尖瓣瓣膜置換術(shù)患者30例，男19例、女11例，年齡38～70歲，ASA分級Ⅱ～Ⅲ級。納入標(biāo)準(zhǔn)：左室射血分?jǐn)?shù)≥45%，無嚴(yán)重腦、肺、肝、腎、內(nèi)分泌異常等合并癥，無手術(shù)史及特殊用藥者。排除標(biāo)準(zhǔn)：CPB停機(jī)失敗需再次CPB者，術(shù)后再次手術(shù)者及臨時改變手術(shù)方式者等。采用隨機(jī)數(shù)字表法將患者隨機(jī)分為對照組(C組)和七氟醚預(yù)處理組(S組)各15例，兩組臨床資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究獲本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并與患者或家屬簽署知情同意書。

1.2麻醉方法應(yīng)用德國Jostra HL-20型體外循環(huán)機(jī)和MAQUET模式氧合器進(jìn)行CPB，期間維持平均動脈壓50～80 mmHg。S組切皮至主動脈阻斷前吸入七氟醚，采用Vamos氣體監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測呼氣末七氟醚(濃度為1.0%)，維持20 min，隨后予以10 min洗脫期，如此重復(fù)2次。本研究中，間斷吸入呼氣末濃度為1.0%七氟醚對心功能受損的心臟瓣膜病患者血流動力學(xué)的變化并無明顯影響。C組麻醉期間不吸入七氟醚。手術(shù)均由同一組配合熟練的醫(yī)護(hù)人員完成，必要時給予血管活性藥物維持循環(huán)穩(wěn)定。

1.3觀察指標(biāo)及檢測分別于麻醉誘導(dǎo)前(T1)、主動脈開放后2 h(T2)、24 h(T3)、48 h(T4)采集患者橈動脈血樣，采用ELISA試劑盒檢測血清中cTnI、MDA水平和SOD活性。于T1和T3時點(diǎn)抽取橈動脈血，立即用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)后提取核蛋白，根據(jù)BCA蛋白定量法說明書，以Western blotting對樣本蛋白進(jìn)行定量檢測。用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行蛋白灰度分析，Nrf2蛋白表達(dá)水平以Nrf2 /Beta-actin蛋白比值表示。記錄主動脈阻斷時間、CPB時間、手術(shù)時間、ICU停留時間、心臟自動復(fù)跳率、血管活性藥物用量和術(shù)后1周心臟左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料呈正態(tài)分布時用±s表示，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計的計量資料比較采用成組t檢驗，重復(fù)測量設(shè)計的計量資料比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；血清MDA水平、SOD活性與Nrf2蛋白表達(dá)水平的關(guān)系采用直線相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組術(shù)中觀察指標(biāo)比較兩組主動脈阻斷時間、CPB時間及手術(shù)時間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1　兩組術(shù)中觀察指標(biāo)比較(min， ± s)

表1　兩組術(shù)中觀察指標(biāo)比較(min， ± s)

組別n主動脈阻斷時間CPB時間手術(shù)時間C組1575±18103±19229±50S組1576±20104±20232±48

2.2 兩組圍術(shù)期血清cTnI、MDA水平及SOD活性變化見表2。

表2　 兩組不同時間點(diǎn)血清cTnI、MDA水平

及SOD活性比較( ± s)

表2　 兩組不同時間點(diǎn)血清cTnI、MDA水平

組別ncTnI(ng/mL)MDA(nmol/mL)SOD(U/mL)C組15 T10.057±0.0313.8±1.152±13 T23.542±0.898*9.7±1.9*34±7* T36.832±1.350*12.4±1.8*29±7* T45.270±1.029*9.0±1.4*40±10*S組15 T10.049±0.0263.9±1.351±13 T22.687±0.753*#7.4±1.7*#40±8*# T34.871±1.286*#9.3±2.1*#36±9*# T43.739±1.109*#5.8±1.6*#48±9#

注：組內(nèi)與T1比較，*P<0.05；與C組同時間點(diǎn)比較，#P<0.05。

2.3兩組Nrf2蛋白表達(dá)水平比較見表3。

表3　 兩組T 1和T 3時Nrf2 /Beta-actin蛋白

比值比較( ± s)

表3　 兩組T 1和T 3時Nrf2 /Beta-actin蛋白

組別nNrf2/Beta-actin蛋白比值T1T3C組150.117±0.0150.266±0.085*S組150.114±0.0170.391±0.095*#

注：組內(nèi)與T1比較，*P<0.05，與C組同時間點(diǎn)比較，#P<0.05。

2.4 MDA水平、SOD活性與Nrf2蛋白表達(dá)的關(guān)系 直線相關(guān)分析MDA水平、SOD活性與Nrf2蛋白表達(dá)水平相關(guān)(r分別為-0.694、0.739，P均<0.05)。

2.5兩組術(shù)后臨床觀察指標(biāo)比較 C、S組術(shù)后LVEF值分別為(54±5)%、(56±6)%，多巴胺用量(248±60)、(222±53)mg， ICU停留時間(64±17)、(62±16)h，心臟自動復(fù)跳率40%、60%，腎上腺素使用3、1例。術(shù)后S組LVEF較C組高(P<0.05)。與C組比較，S組多巴胺用量減少(P<0.05)，心臟自動復(fù)跳率、腎上腺素使用例數(shù)和ICU停留時間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

3討論

圍術(shù)期患者血清中cTnI水平能早期準(zhǔn)確反映心肌損傷水平。本研究結(jié)合預(yù)試驗結(jié)果并參考相關(guān)文獻(xiàn)[7~9]，選擇在切皮至主動脈阻斷前間斷吸入七氟醚，維持呼氣末濃度1.0%持續(xù)20 min，隨后予以10 min洗脫期，如此重復(fù)2次。結(jié)果顯示，在主動脈開放后各時點(diǎn)七氟醚預(yù)處理組cTnI水平明顯低于對照組，提示七氟醚預(yù)處理具有減輕CPB下心臟瓣膜置換術(shù)患者心肌損傷的作用[10]。

Nrf2是CNC 轉(zhuǎn)錄因子家族中活性最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)元件(Nrf2/ARE)信號傳導(dǎo)通路是目前發(fā)現(xiàn)最重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路。在生理狀態(tài)下，Nrf2與胞質(zhì)蛋白伴侶(Keap1)形成二聚體，處于非活性狀態(tài)，經(jīng)過泛素蛋白酶途徑被迅速降解。當(dāng)機(jī)體受親核劑或活性氧簇刺激時，Nrf2轉(zhuǎn)錄表達(dá)增加并與Keap1解離，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核與ARE基因序列結(jié)合，啟動并增強(qiáng)下游抗氧化及解毒基因的轉(zhuǎn)錄活性，包括抗氧化蛋白酶及Ⅱ相解毒酶即SOD、血紅素氧合酶等，這些蛋白可清除氧自由基，減少過氧化物釋放，減輕氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞損傷[11]。

本研究結(jié)果顯示，主動脈開放后24 h時兩組PBMC核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)均較術(shù)前增高，七氟醚預(yù)處理組核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)較對照組顯著增高，與Huang等[4，12]研究結(jié)果相一致，表明七氟醚預(yù)處理明顯增加了CPB下心臟瓣膜置換術(shù)患者PBMC核內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá)。本研究表明，與對照組比較，七氟醚預(yù)處理組主動脈開放后各時點(diǎn)患者血清中MDA水平降低，SOD活性升高，且MDA水平與Nrf2蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，SOD活性與Nrf2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，提示七氟醚預(yù)處理可以減弱CPB下心臟瓣膜置換術(shù)患者脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激能力，可能與增強(qiáng)體內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)，啟動Nrf2/ARE信號傳導(dǎo)通路，表達(dá)下游抗氧化物酶等有關(guān)[13]。兩組術(shù)后LVEF值均較術(shù)前降低，可能與手術(shù)創(chuàng)傷等因素有關(guān)，而術(shù)后LVEF值七氟醚預(yù)處理組較對照組高，且血管活性藥物多巴胺用量少，提示七氟醚預(yù)處理有利于加快患者心功能的恢復(fù)。

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