miR-17-5p在宮頸癌組織中的表達(dá)變化及其對宮頸癌細(xì)胞生長增殖影響

魏倩，張鵬

(天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心及天津市腫瘤防治重點實驗室,天津300060)

摘要：目的觀察miR-17-5p在宮頸癌組織中的表達(dá)變化及其對宮頸癌細(xì)胞生長和增殖的影響。方法用實時熒光定量PCR法對20例宮頸癌患者的癌組織和癌旁組織中的miR-17-5p進(jìn)行檢測。將人宮頸癌細(xì)胞株HeLa分組，分別轉(zhuǎn)染人工構(gòu)建的miR-17-5p質(zhì)粒、陰性對照質(zhì)粒、miR-17-5p的反義寡核苷酸質(zhì)粒及無關(guān)序列寡核苷酸質(zhì)粒，采用MTT法和平板克隆形成實驗檢測細(xì)胞生長活性和克隆數(shù)目。結(jié)果宮頸癌組織、癌旁組織中miR-17-5p的相對表達(dá)量分別為0.315±0.185、1.143±1.373，兩者相比，P<0.05。與轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-17-5p質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞生長活性、克隆形成率明顯降低(P均<0.05)；與轉(zhuǎn)染無關(guān)序列寡核苷酸質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-17-5p的反義寡核苷酸質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞生長活性、克隆形成率明顯升高(P均<0.05)。結(jié)論 宮頸癌組織中miR-17-5p表達(dá)減少，其可抑制宮頸癌細(xì)胞的生長和增殖。

關(guān)鍵詞：多順反子miRNA基因；miR-17-5p基因；宮頸腫瘤；宮頸癌；宮頸癌細(xì)胞；細(xì)胞生長；細(xì)胞增殖

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.43.003

中圖分類號：R737.33 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項目：天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院科學(xué)研究基金資助項目(Y1207)。

作者簡介：第一魏倩(1987-)，女，碩士研究生，檢驗技師，主要研究方向為分子生物學(xué)及臨床檢驗診斷。E-mail： weiqian19870729@163.com

作者簡介：通信張鵬(1956-)，男，教授，主任技師，主要研究方向為臨床檢驗診斷。E-mail： laopang.56@163.com

收稿日期：(2015-07-06)

Expression changes of miR-17-5p in cervical cancer tissues and its

effects on cervical cancer cell growth and proliferation

WEIQian,ZHANGPeng

(TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital,NationalClinicalResearchCenterofCancer,

KeyLaboratoryofCancerPreventionandTherapy,Tianjin300060,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the expression changes of miR-17-5p in the cervical cancer tissues and its effects on cervical cancer cell growth and proliferation. MethodsThe levels of miR-17-5p in cervical cancer tissues and adjacent tissues of 20 patients were detected by real-time quantitative PCR. We divided the human cervical cancer cell line HeLa into different groups, which were respectively transfected by artificial miR-17-5p plasmid, negative control plasmid, miR-17-5p antisense oligonucleotide (ASO) plasmid and irrelevant sequence oligonucleotide plasmid. MTT and colony experiment were used to detect the growth activity and clone number.ResultsThe relative expression of miR-17-5p in the cervical cancer tissues and adjacent tissues were 0.315±0.185 and 1.143±1.373 (P<0.05). The cell growth and cloning efficiency of HeLa cells transfected with pri-miR-17-5p were significantly decreased as compared with those of HeLa cells transfected by negative control plasmid (all P<0.05); the cell growth and cloning efficiency of HeLa cells transfected with pri-miR-17-5p ASO were significantly increased as compared with those of HeLa cells transfected by irrelevant sequence oligonucleotide plasmid (all P<0.05). Conclusion The expression of miR-17-5p was significantly down-regulated in the cervical cancer tissues, which inhibited the cell growth and proliferation of cervical cancer cells.

Key words: polycistronic mRNA; miR-17-5p gene; cervical neoplasms; cervical carcinoma; cervical carcinoma cells; cell growth; cell proliferation

miR-17-5p在不同腫瘤組織中的表達(dá)水平是不同的，在多種惡性實體瘤如肺癌、胃癌及肝癌等腫瘤中呈過表達(dá)[1～3]，而在乳腺癌和鼻咽癌等腫瘤中因該基因簇所在染色體區(qū)段的雜合性缺失導(dǎo)致其呈低表達(dá)[4]。上述研究結(jié)果表明miR-17-5p在不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了不同的生物學(xué)角色[5]。2014年1月，我們對miR-17-5p在宮頸癌組織中的表達(dá)變化及其對宮頸癌細(xì)胞生長和增殖的影響進(jìn)行了觀察。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1材料與方法

1.1標(biāo)本、細(xì)胞及試劑來源經(jīng)病理學(xué)檢查確診的人宮頸癌組織及其對應(yīng)正常宮頸組織標(biāo)本各20例份、人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、pcDNA3/pri-miR-17-5p質(zhì)粒及其陰性對照質(zhì)粒pcDNA3由天津醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)實驗中心提供。miR-17-5p的反義寡核苷酸(ASO-miR-17-5p)序列為5′-CUACCUGCACUGUAA-GCACUUUG-3′，其無關(guān)序列寡核苷酸(NC-ASO)序列為5′-GTGGATATTGTTGCCATCA -3；ASO-miR-17-5p質(zhì)粒及NC-ASO質(zhì)粒(即ctrl質(zhì)粒)購自美國Integrated DNA Technology公司。熒光定量PCR的miR-17-5p引物購自北京奧科生物技術(shù)有限公司。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 購自美國Invitrogen 公司。反轉(zhuǎn)錄酶購自美國Promega公司。實時熒光定量PCR的2×SYBR Green Master Mix 購自日本Takara公司。GAPDH 多克隆抗體以及羊抗兔二抗購自天津賽爾生物技術(shù)有限公司。

1.2宮頸癌及癌旁組織中miR-17-5p的檢測采用實時熒光定量PCR法。TRIzol提取受檢組織中的RNA(紫外分光光度計檢測OD260/OD280為1.8～2.0)，逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，然后進(jìn)行PCR。PCR擴增引物反應(yīng)體系為2×SYBR Premix Ex Taq酶10.0 μL，加入PCR Forward Primer及PCR Reverse Primer各1 μL,同時加入模板(CDNA)2 μL，補反應(yīng)體系至20 μL；循環(huán)94 ℃ 4 min，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達(dá)量，ΔΔCt=(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4)，Ct1為處理樣品待測基因(miR-17-5p)的臨界循環(huán)數(shù)，Ct2為處理樣品持家基因(U6)的臨界循環(huán)數(shù)，Ct3為對照樣品待測基因(miR-17-5p)的臨界循環(huán)數(shù)，Ct4為對照樣品持家基因(U6)的臨界循環(huán)數(shù)。

1.3HeLa細(xì)胞培養(yǎng)、miR-17-5p基因轉(zhuǎn)染及封閉測試①細(xì)胞培養(yǎng)：HeLa細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在 5% CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)?；蜣D(zhuǎn)染前的第1天將細(xì)胞接種到6孔板的培養(yǎng)板中。②基因轉(zhuǎn)染測試：取HeLa細(xì)胞，分為pcDNA3/pri-miR-17-5p組及其對照組(pcDNA3組)、ASO-miR-17-5p組及其對照組(ctrl組)。各組細(xì)胞接種于24孔板，每組3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后上每組每孔分別轉(zhuǎn)染1 μg的pcDNA3/pri-miR-17-5p、pcDNA3、ASO-miR-17-5p、ctrl質(zhì)粒。48 h后TRIzol法提取各組受檢細(xì)胞中的RNA，紫外分光光度計檢測OD260/OD280為1.8～2.0，逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，然后進(jìn)行PCR擴增，具體方法及結(jié)果計算同“1.2”。結(jié)果顯示，與pcDNA3組相比， pcDNA3/pri-miR-17-5p組HeLa細(xì)胞中miR-17-5p表達(dá)水平提高約1.5倍；ASO-miR-17-5p組HeLa細(xì)胞中miR-17-5p的表達(dá)水平降低為ctrl組的30%左右。上述結(jié)果表明miR-17-5p基因可成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入HeLa細(xì)胞，HeLa細(xì)胞中的miR-17-5p基因也可成功被封閉，可進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4miR-17-5p基因轉(zhuǎn)染及封閉后HeLa細(xì)胞生長情況觀察①miR-17-5p基因轉(zhuǎn)染及封閉后HeLa細(xì)胞吸光度值(A值：反映細(xì)胞活性)檢測：采用MTT法檢測HeLa細(xì)胞A值。HeLa細(xì)胞傳代培養(yǎng)第2天、密度達(dá)70%～80%時,取對數(shù)生長期、狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于96孔板，分四組(同“1.3”)，每組設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)24、36、72 h三個時間點。pcDNA3/pri-miR-17-5p組、pcDNA3組、ASO-miR-17-5p組、ctrl組每孔分別轉(zhuǎn)染0.15 μg的pcDNA3/pri-miR-17-5p、pcDNA3、ASO-miR-17-5p、ctrl質(zhì)粒。于三個時間點分別取出培養(yǎng)板，每孔加MTT 10 μL，置37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)4 h；取出培養(yǎng)板，2 000 g離心5 min，棄上清，每孔加100 μL的DMSO終止反應(yīng)并溶解甲臜藍(lán)紫色顆粒，避光震蕩混勻5 min，分光光測度計測波長570 nm處的A值。②miR-17-5p基因轉(zhuǎn)染及封閉后HeLa細(xì)胞集落形成觀察：采用平板克隆實驗。HeLa細(xì)胞培養(yǎng)第2天、密度達(dá)到80%時,取對數(shù)生長期、狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于48孔板中，分四組(同“1.3”)，每組設(shè)3個復(fù)孔。pcDNA3/pri-miR-17-5p組、pcDNA3組、ASO-miR-17-5p組、ctrl組每孔分別轉(zhuǎn)染0.5 μg的pcDNA3/pri-miR-17-5p、pcDNA3、ASO-miR-17-5p、ctrl質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后36 h，棄原培養(yǎng)液，用1×PBS浸洗1次，消化液消化，加入含有10% FBS(不含抗生素)的培養(yǎng)液，終止消化并吹打成細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞密度后接種于12孔板，并設(shè)置最終細(xì)胞數(shù)為100/孔，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，每3 d更換1次培養(yǎng)液，以細(xì)胞數(shù)≥50個作為集落形成的標(biāo)準(zhǔn)，直至12孔板中集落之間發(fā)生互相融合后結(jié)束計數(shù)。細(xì)胞集落形成率=(細(xì)胞集落數(shù)/初始接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料兩兩比較用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1宮頸癌及癌旁組織中miR-17-5p的表達(dá)比較宮頸癌組織中miR-17-5p的相對表達(dá)量為0.315±0.185，癌旁組織為1.143±1.373，兩者相比，P<0.05。

2.2各組HeLa細(xì)胞A值比較不同時間點各組HeLa細(xì)胞A值比較見表1。表1表明,miR-17-5p可以抑制HeLa細(xì)胞的生長活性。

表1　不同時間點各組HeLa細(xì)胞A值比較

注：與pcDNA3組相比，*P<0.05；與ctrl組相比，#P<0.05。

2.3各組HeLa細(xì)胞集落形成率比較pcDNA3/pri-miR-17-5p組、pcDNA3組的HeLa細(xì)胞集落形成率分別為15%±2%、29%±2%，兩組相比，P<0.05；ASO-miR-17-5p組、ctrl組HeLa細(xì)胞的集落形成率分別為37%±1%、23%±1%，兩組相比，P<0.05。表明miR-17-5p可以抑制HeLa細(xì)胞的增殖。

3討論

miR-17-92是一個典型的多順反子miRNA基因簇。在人類基因組中, miR-17-92位于染色體13q31.3上一個約長7 kb的初級轉(zhuǎn)錄本C13orf25的第3個內(nèi)含子上，編碼6個成熟miRNA，包括miR-17-5p。這些miRNA的序列和組成在所有脊椎動物中是高度保守的，但在不同的腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有不同的生物學(xué)功能[6]。編碼miR-17-92簇的基因組位點在大B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡淋巴瘤等多種腫瘤中出現(xiàn)擴增，導(dǎo)致其在這些腫瘤中高表達(dá)[7]。此外，miR-17-92簇在血液系統(tǒng)腫瘤和多種惡性實體瘤中同時存在過表達(dá)[1～3]。從上述研究結(jié)果可以看出,miR-17-92在細(xì)胞的生命活動中發(fā)揮了癌基因的作用。Tagawa等[8]研究指出，miR-17-92與C-myc的表達(dá)密切相關(guān)，miR-17-92和C-myc都能調(diào)控細(xì)胞周期轉(zhuǎn)錄因子E2F1，說明原癌基因myc-E2F1轉(zhuǎn)錄激活了miR-17-92簇。另一方面，miR-17-92簇又能負(fù)性調(diào)控E2F1的活性，抑制細(xì)胞周期進(jìn)展，反饋抑制了C-myc促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，由此認(rèn)為其又具有潛在的抑癌作用。除此之外，miR-17-92還可以抑制細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老，同時對新生血管的形成和腫瘤的轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p在宮頸癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，提示miR-17-5p可能在宮頸癌的發(fā)生中扮演抑癌基因的角色。

為了研究miR-17-5p在宮頸癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用，我們將pcDNA3/pri-miR-17-5p質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞HeLa，提高了其miR-17-5p表達(dá)水平，結(jié)果HeLa細(xì)胞生長活性明顯減低，細(xì)胞集落形成能力明顯受抑制。表明在宮頸癌細(xì)胞中的miR-17-5p具有抑制細(xì)胞生長活性和增殖的作用，進(jìn)一步證實miR-17-5p在宮頸癌中發(fā)揮了抑癌基因的角色。

原癌基因和抑癌基因的表達(dá)水平發(fā)生失調(diào)性的改變對于所有腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要作用[10,11]。miRNA的異常表達(dá)已經(jīng)在腫瘤的惡性發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮了重要作用，成為了一種新型的腫瘤診斷和治療的候選靶點[12,13]。我們推測miR-17-5p的抑制細(xì)胞生長和增殖的作用是通過對其靶基因的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，影響靶基因的表達(dá)水平，從而調(diào)節(jié)下游的各生物學(xué)過程。

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