·實驗研究·

板藍根乙酸乙酯部位體外抗病毒活性研究

何立巍，楊婧妍，董偉，秦瑩亞

(南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京 210046)

摘要：目的對板藍根的乙酸乙酯部位各化學組分進行體外抗單純皰疹病毒Ⅰ型(HSV1)活性研究。方法利用溶劑法和色譜法從板藍根中提取分離出20個乙酸乙酯組分，利用四甲基偶氮唑鹽比色(MTT)法檢測這20個組分體外對HSV1病毒的抑制作用,以細胞存活率、治療指數(TI)和細胞保護率為評價指標，比較各化學組分的體外抗病毒的效果。結果 板藍根乙酸乙酯8個組分均有明顯的抗HSV1病毒作用，對病毒的抑制率均遠大于50%。結論 板藍根乙酸乙酯部位中存在直接抗病毒較強的活性成分，對其結構進行深入研究，將有助于闡明板藍根抗病毒藥效物質基礎。

關鍵詞：板藍根；乙酸乙酯部位；抗病毒；四甲基偶氮唑鹽比色法

基金項目：國家自然基金資助項目(No.81073023,No.81073023)；國家教育部博士點基金資助項目(No.20093237120015)

作者簡介：何立巍，男，副教授，研究生導師，研究方向：中藥及天然藥物活性成分及物質基礎研究，E-mail:he_lw@163.com

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：A

Study on antiviral activity ofRadixIsatidisethyl acetate extract in vitro

HELi-wei,YANGJing-yan,DONGWei,QINYing-ya

(CollegeofPharmacy,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210046,China)

Abstract：ObjectiveTo research the antiviral activity against herpes simplex virus type Ⅰ (HSV1) activity of each chemical component of Radix Isatidis extracted with ethyl acetate in vitro.MethodsExtracting and separating 20 components from Radix Isatidis in ethyl acetate using solvent and chromatography methods.Detecting this 20 components inhibition to HSV1 virus in vitro using MTT assay，with cell viability，therapeutic index (TI) and cell protection rate as evaluation indexes,and comparing the antiviral activities of each component in vitro.ResultsEight components of Radix Isatidis had significant anti-viral effect of HSV-1.Inhibition rate to the virus was much greater than 50%.ConclusionThere were strong antiviral of active ingredients in Radix Isatidis.In-depth study of its structure would help to clarify the material basis of antiviral effect of Radix Isatidis.

Key words:RadixIsatidis；Ethyl acetate extract;Antiviral;MTT method

板藍根是十字花科植物菘藍IsatisindigoticaFort.的干燥根，具有清熱解毒、涼血利咽之功效。藥理研究證實，板藍根提取液對流感病毒、乙型肝炎病毒、單純皰疹病毒、柯薩奇病毒、腎綜合征出血熱病毒、巨細胞病毒等均有顯著的抑制作用。故臨床上廣泛用于抗病毒、抗菌，并具有抗腫瘤，增強機體免疫力的功能，抗內毒素作用[1～4]。為了明確板藍根抗病毒的物質基礎，指導其活性成分的分離和純化，本實驗采用細胞病變效應(CPE)法和 MTT 法[5]對板藍根乙酸乙酯部位的抗病毒活性進行了篩選。

1儀器與材料

1.1實驗儀器96孔板(美國Corning公司);Power Wave 340型酶標儀(美國Bio-Teck公司);BC- J80S型CO2培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司);CKX31SF型顯微鏡(Olympus);SW-CT-1F型單人雙面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司);79-1型磁力加熱攪拌器(江蘇省金壇醫(yī)療儀器廠);SYQ-DSX-280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);實驗室級超純水器(易普易達);LDZ5-2型低速自動平衡離心機(北京醫(yī)用離心機廠)。

1.2實驗病毒與細胞株人類單純皰疹病毒Ⅰ型(HSV-Ⅰ)傳代2次，以提高病毒毒力，由南京醫(yī)科大學病毒所提供；非洲綠猴腎(vero)細胞(為HSV型病毒敏感細胞，由南京醫(yī)科大學病毒所提供)，常規(guī)培養(yǎng)于含10%FCS的 RPMI 1640生長液中，內含青霉素0.06 mg·mL-1，鏈霉素0.1 mg·mL-1，NaHCO32 mg·mL-1，37 ℃培養(yǎng)生長成單層，待用。

1.3實驗藥品與試劑板藍根藥材以95%乙醇10倍量、8倍量提取2次，合并提取液，減壓濃縮乙醇至無醇味，分別以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得乙酸乙酯部位12.6 g；取乙酸乙酯部位以硅膠吸附柱色譜進行分離，以石油醚-乙酸乙酯(100∶1~100∶50梯度洗脫)，收集各流分，薄層色譜檢查，相同化學成分流份合并，得乙酸乙酯各化學組分1~20；各樣品用DMSO(二甲基亞砜)溶解，至濃度為200 mg·mL-1，作為供試樣品母液。

10%新生小牛血清(中美合資蘭州民海生物工程有限公司，批號：20050629)， RPMI 1640培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)， 100TCID50 病毒液(病毒傳代培養(yǎng)后由南京中醫(yī)藥大學微生物與免疫教研室配制)。其余化學試劑如石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等均為分析純。

2實驗方法與結果

2.1細胞的培養(yǎng)與傳代非洲綠猴腎(vero)細胞為貼壁生長型細胞，常規(guī)復蘇后傳代培養(yǎng)。Vero細胞在100 mL·L-1胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,含50 mL·L-1二氧化碳，37 ℃，濕度95%培養(yǎng)箱內密閉單層培養(yǎng)。

2.2藥物無毒界限的測定取生長良好的vero細胞，經胰酶消化后,加含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基,制備細胞數為2×105·mL-1的懸浮液，加至96孔平底細胞培養(yǎng)板，0.1 mL/孔，37 ℃ 5%CO2溫育24 h細胞長成單層，吸棄單層細胞上的培養(yǎng)液。將樣品溶液分別稀釋為10個濃度液體,分別為：2 000、1 000、500、200、100、40、20、8、4、0.8 μg·mL-1。分別加入各細胞孔中,每孔加入0.2 mL，每一稀釋度設立4孔，同時設立2個細胞對照組。37 ℃ 5%CO2溫育72 h后每孔加入MTT 20 μL,再放入37 ℃ 5%CO2溫育培養(yǎng)箱4 h后，吸棄上清液，每孔加二甲基亞砜(DMSO)200 μL，振蕩5～10 min，使顆粒溶解，用酶標免疫檢測儀測490 nm處吸光度(OD)的值，計算細胞存活率。細胞存活率=實驗孔OD值/細胞對照孔OD值。無明顯細胞毒性(存活率大于80%)表現(xiàn)的濃度即為藥液的無毒界限[6]。實驗結果顯示藥物的無毒最高濃度如表1。

表1　細胞毒性測定(存活率法)

2．3抗病毒活性篩選取生長良好的vero細胞，經胰酶消化后,加含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基，制備細胞懸浮液，將細胞加入96孔板制成單層(約4×104/孔)，0.1 mL/孔，37 ℃ 5%CO2溫育24 h細胞長成單層，吸棄單層細胞上的培養(yǎng)液。加入40 μL/孔的病毒液，細胞組加入40 μL/孔的PBS液，放入CO2孵育箱1 h，使病毒吸附于細胞上。將藥液以無毒界限為最高濃度作4個稀釋度(如表1)分別加入細胞孔中,每一稀釋度設3孔,同時設立病毒對照組、細胞對照組，37 ℃ 5%CO2作用72 h,接著加入MTT，每孔20 μL，37 ℃ 5%CO2作用4 h后棄上清加入DMSO,每孔200 μL，振蕩5～10 min,待結晶完全溶解用酶標免疫檢測儀測490 nm處OD值,計算細胞保護率。

細胞保護率=(實驗孔OD值-病毒對照孔OD值)/(細胞對照孔OD值-病毒對照孔OD值)。

病毒感染細胞3天后，MTT法測細胞保護率，結果顯示，隨著藥物濃度的增高細胞保護率增高。最大保護率大于50%的藥物為1、9、13、14、15、16、17、19號，最大保護率大于30%、小于50%的藥物為4、5、8號，結果詳見表2。

按Reed-Muench方法計算半數毒性濃度(TC50)[2]。TC50=lg-1[lgCm-I(P總-0.5)]；其中Cm表示最大濃度，I表示lg(Cm/與Cm相臨的濃度)，P總表示所有濃度的總抑制率，結果見表3。

表2　各組分對 HSV-1 感染的保護作用(MTT法)

表3　各組分的半數毒性濃度(TC 50)

按Reed-Muench方法計算細胞存活率、藥物半數抑制病毒濃度(IC50),lgIC50=lgCm-I[P總-(3-Pm-Pn)/4]；以治療指數(TI)評價藥物抗HSV1的效果,其中TI=TC50/IC50，結果見表4。

表4　各組分的半數抑制病毒濃度(IC 50)

3討論

本實驗針對板藍根乙酸乙酯化學部位，通過柱色譜的方法作了進一步的分離，得到化學成分較為集中的各化學組分(單體或幾個單體的活混合物)，在對其抗病毒活性篩選研究組中發(fā)現(xiàn)，9、16、17、19號組分的抗病毒作用最強，且治療窗較小，可能為直接抗病毒作用，對這些組分做進一步結構方面的研究，將有可能發(fā)現(xiàn)板藍根新的抗病毒活性成分，并進一步闡明板藍根抗病毒物質基礎。

參考文獻：

[1]周黃金，劉干中.中藥藥理與臨床研究進展[M].北京：中國科學技術出版社，1992：357.

[2]許益明，陸平成，王永珍，等.板藍根多糖促進免疫功能的實驗研究[J].中西醫(yī)結合雜志，1991，11(6)：357.

[3]孫深.臨床用藥大全[M].上海：中國大百科全書出版社上海分社，1995：656.

[4]劉云海.板藍根抗內毒素作用研究[J].中國藥科大學學報，1995，26(5)：297.

[5]湯杰，施春陽，徐晗，等.板藍根抑菌抗炎活性部位的評價[J].中國醫(yī)院藥學雜志,2003,23(6):327-328.

[6]何立巍，李祥，陳建偉，等.板藍根抗病毒有效部位的篩選[J].中國藥房，2008，19(33)：2565-2566.