HLPC法測(cè)定感冒止咳顆粒中葛根素的含量

李媛，李強(qiáng)

(東營(yíng)市食品藥品檢驗(yàn)中心，山東 東營(yíng) 257091)

摘要：目的采用高效液相色譜法測(cè)定感冒止咳顆粒中葛根素的含量。方法Agilent Eclipse XDB-C18柱 ( 4.6 mm×200 mm，5 μm)；以甲醇-水溶液(28∶72) 為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，流速為1.0 mL·min-1，柱溫：35 ℃。理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。 結(jié)果 葛根素與其相鄰雜質(zhì)峰能完全分離，葛根素進(jìn)樣量在0.088 22~0.441 1 μg 之間與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=1.000 0，平均加樣回收率為97.66%，RSD=0.8017%(n=6)。結(jié)論 本方法操作簡(jiǎn)便，精密度好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于感冒止咳顆粒的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：感冒止咳顆粒；葛根素；含量測(cè)定；高效液相色譜法

作者簡(jiǎn)介：李媛，女，研究方向：中藥學(xué)，E-mail:licc22@163.com

中圖分類號(hào)：R927.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Determination of puerarin in Ganmao Zhike Granules by HPLC

LIYuan,LIQiang

(DongyingCenterforFoodandDrugControl,Dongying257091,China)

Abstract：ObjectiveTo establish a method for the determination of puerarin in Ganmao Zhike Granules by HPLC.MethodsThe C18 column (4.6 mm× 200 mm，5 μm) was adopted with the mobile phase of methanol-water(28∶72)at the flow rate o f 1.0 mL·min-1，and the detection wavelength was 250 nm.Theoretical plate number should not be less than 4 000 according to the puerarin peak.ResultsThe date showed that this method could clearly separate puerarin peak from its nearby impurity peaks，with a better linear range of 0.008 82~ 0.441 1 μg(R2=1.000 0)，and the average recovery was 97.66% and the RSD was 0.801 7% (n=6).ConclusionThis method was simple，accurate and reliable，so it can be used for the quality control of Ganmao Zhike Granules.

Key words:Ganmao Zhike Granules;Puerarin;Determination;HPLC

感冒止咳顆粒處方來源于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第二冊(cè)收載的感冒止咳沖劑(WB3-B-0446-90)，是由柴胡、金銀花、黃芩、連翹、葛根、青蒿、苦杏仁、桔梗、薄荷腦組成。輔料為蔗糖的中藥成方制劑。感冒止咳顆粒用于治療感冒發(fā)熱引起的頭痛、鼻塞、傷風(fēng)、咳嗽、咽喉腫痛、四肢怠倦等癥。藥品中葛根用量較大，而葛根中主要含異黃酮成分葛根素、葛根素木糖苷等成分。其中的葛根素具有可有效逆轉(zhuǎn)化學(xué)誘導(dǎo)的肝纖維化，增強(qiáng)心肌收縮力，擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)，保護(hù)紅細(xì)胞的變形能力，增強(qiáng)造血系統(tǒng)功能，具有抗血小板聚集，增加纖溶活性，降低血粘度作用，對(duì)非特異性免疫、體液免疫、細(xì)胞免疫有明顯的調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)正常人和腫瘤病人的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，增強(qiáng)自然素作用，對(duì)干擾系統(tǒng)有明顯的刺激和誘生作用[1~4,8]。

感冒止咳顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)簡(jiǎn)單，僅有連翹、葛根素、綠原酸鑒別項(xiàng)和黃芩苷的含量測(cè)定項(xiàng)[2]，因藥品中葛根藥效大、用量較大、文獻(xiàn)資料較少，故本實(shí)驗(yàn)以葛根素為指標(biāo)，采用高效液相色譜法測(cè)定含量，以控制感冒止咳顆粒的質(zhì)量，以保證病人用藥的有效性。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器Agilent 1200 series 高效液相色譜系統(tǒng)，包括在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器；KQ-50B型超聲清洗器；Mettler Toledo電子天平。

1.2試藥葛根素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110752-200912，供含量測(cè)定使用，以96.0%計(jì))；甲醇為色譜純，水為去離子純化水，其余試劑為分析純；感冒止咳顆粒(生產(chǎn)廠家：太極特格爾，批號(hào)：13020005B、13020013B、13030002B、13030015B、13050007B；云南白藥，批號(hào)：ZAB1302、ZAB1309、ZAB1311、ZAB1333、ZAB1342；北京同仁堂，批號(hào)：2112006、2112017、2113011、2114004、2114016)。

2方法和結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Eclipse-XDB-C18柱(4.6×200 mm，5 μm)；流動(dòng)相:甲醇-水(28∶72)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)[5]：250 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥12 h的葛根素對(duì)照品0.014 36 g，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。精密量取此貯備液2.00 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成濃度為44.11 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.3供試品溶液的制備3種樣品，每種樣品5個(gè)批號(hào)，各取約10 g，研細(xì)。精密稱取約1 g，置于50 mL容量瓶中，精密加入甲醇30 mL，超聲處理30 min，放冷，用甲醇定容到刻度，過濾，棄去初濾液，續(xù)濾液用孔徑0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4陰性樣品溶液的制備[6]按處方制備不含葛根素的陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制得陰性樣品溶液。

2.5系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液與陰性樣品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液中葛根素能達(dá)到基線分離，樣品中其他成分對(duì)葛根素測(cè)定無干擾，理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000，見圖1~3。

圖1　葛根素對(duì)照品HPLC色譜圖

圖2　感冒止咳顆粒HPLC色譜圖

圖3　感冒止咳顆粒陰性樣品HPLC色譜圖

2.6線性關(guān)系考察精密吸取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液2、4、6、8、10 μL分別注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積積分值，以葛根素的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程Y=3 940.2X-7.580 0，R2=1.000 0。結(jié)果表明，葛根素進(jìn)樣量在范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.7精密度試驗(yàn)精密吸取葛根素對(duì)照品溶液(44.11 μg·mL-1)5 μL,連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積積分值，結(jié)果RSD=0.18%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取供試品溶液5 μL，在0～24 h內(nèi)進(jìn)樣6次(0、2、4、8、12、24 h),測(cè)定峰面積，以考察樣品溶液在檢測(cè)過程中待測(cè)成分的穩(wěn)定性。結(jié)果RSD為1.59%(n=6)，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，能夠滿足測(cè)定需要。

2.9重現(xiàn)性試驗(yàn)取樣品(云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：ZAB1311)平行制備5份供試品溶液，按上述條件和方法進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算含量。結(jié)果葛根素的平均含量為2.502 mg·g-1，RSD為0.194 9%。表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.10加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量為2.435 mg·g-1的樣品(云南白藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn))約0.5 g，共6份，加入濃度為44.11 μg·mL-1葛根素對(duì)照品溶液30 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定含量并計(jì)算回收率，結(jié)果葛根素平均回收率為97.66%，RSD為0.801 7%。

2.11樣品含量測(cè)定取3種感冒止咳顆粒樣品(太極特格爾、云南白藥、北京同仁堂)，分別按“2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，每個(gè)批號(hào)制備一個(gè)供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定并計(jì)算葛根素含量，結(jié)果見表1。

表1　3種感冒止咳顆粒中葛根素含量測(cè)定結(jié)果

3討論

3.1提取溶劑的選擇[1,7]筆者比較了95%乙醇、50%乙醇和甲醇3種溶劑在超聲時(shí)間相同的情況下對(duì)樣品中葛根素的提取效果，發(fā)現(xiàn)以50%乙醇作為溶劑的提取效果稍好。但由于樣品中含有一定比例的蔗糖和糊精，因此經(jīng)50%乙醇超聲處理得到的供試品溶液含糖量高、粘度大，如果直接用于液相色譜測(cè)定，會(huì)嚴(yán)重?fù)p害色譜柱，且雜質(zhì)峰較多；用甲醇提取能有效去除糖及其他雜質(zhì)，且簡(jiǎn)化操作步驟，故選用甲醇作為提取溶劑。

3.2提取時(shí)間的選擇分別對(duì)15、20、30、45 min不同提取時(shí)間進(jìn)行考察。結(jié)果顯示15、20 min提取不完全，而提取30 min和60 min效果相當(dāng)，故提取方法確定為超聲處理30 min。

3.3流動(dòng)相的選擇[1,7]考察了不同溶劑系統(tǒng)[甲醇-0.3%磷酸溶液(25∶75)、甲醇-水(28∶72)、甲醇-水(25∶75)、甲醇-水(30∶70)]。最終結(jié)果表明以甲醇-水(28∶72)為流動(dòng)相時(shí)，分離度及峰形較好。

3.4柱溫的選擇考察了HPLC法柱溫對(duì)葛根素分離度和峰形的影響，結(jié)果表明柱溫為35 ℃時(shí)，葛根素峰形和分離度最好。

4結(jié)論

4.1在進(jìn)行藥物含量測(cè)定的探索性研究中，要嘗試采用不同的提取方法、提取溶劑、提取時(shí)間、流動(dòng)相等多方面因素綜合分析，確定最佳的實(shí)驗(yàn)方案。

4.2葛根素在甲醇中溶解，以甲醇超聲處理30 min進(jìn)行提取試驗(yàn)，測(cè)得含量最高。換做其他溶劑提取液中含有一定比例的蔗糖和糊精，對(duì)色譜柱損壞大。考察提取時(shí)間參照文獻(xiàn)并通過對(duì)不同提取時(shí)間的考察，以半小時(shí)為宜。

4.3本文測(cè)定方法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可有效的控制感冒止咳顆粒的質(zhì)量。

4.4通過測(cè)定3家不同廠家生產(chǎn)的各5批感冒止咳顆粒，含量存在一定的差別(太極特格爾：11.458 mg/袋；云南白藥：25.122 mg/袋；北京同仁堂：18.774 mg/袋),可能是因?yàn)椴煌瑥S家的生產(chǎn)工藝不同，并且葛根原料來源不同。根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版(一部)葛根中葛根素含量標(biāo)準(zhǔn)，按干燥品計(jì)算，含葛根素(C21H20O9)不得少于2.4%，故計(jì)算每袋藥品須含葛根素24 mg，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果只有云南白藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)的感冒止咳顆粒符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

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