趙 婷 韓笑天 詹天榮① 趙衛(wèi)紅

(1. 青島科技大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院 青島 266042; 2. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島266071; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 青島 266237)

能源危機(jī)與環(huán)境問(wèn)題的日益加劇, 使人們?cè)絹?lái)越關(guān)注清潔的可再生能源。生物柴油作為可再生能源的一種, 因其眾多的優(yōu)點(diǎn)已日漸成為石油燃料的替代品(黃超雄等, 2012; Rashid et al, 2014)。在眾多的生物柴油原料中, 微藻被認(rèn)為是最有潛力制成生物柴油的生物質(zhì)資源(李元廣等, 2009; Mofijur et al,2013)。微藻中油脂含量可觀, 且微藻脂肪酸一般由14—20個(gè)碳鏈組成, 與生物柴油的 14—18個(gè)左右的碳鏈數(shù)相近(韓笑天等, 2008; 李華等, 2011), 所以從微藻中提取得到的油脂成分可以作為生物柴油直接應(yīng)用于工業(yè)上, 具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。由微藻油脂制備生物柴油正日益被視為一個(gè)可持續(xù)和可行的替代陸地生物能源作物的常規(guī)原料(Doan et al, 2011)。因此開(kāi)發(fā)微藻油脂是可持續(xù)利用海洋資源, 解決能源危機(jī)及環(huán)境污染的最佳選擇之一。

微藻除作為生物柴油的原料之外, 也是高價(jià)值化學(xué)藥品和醫(yī)藥品的重要來(lái)源。微藻中的多不飽和脂肪酸(PUFA)尤其是二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA) 對(duì)海洋動(dòng)物和人類(lèi)都具有營(yíng)養(yǎng)學(xué)和醫(yī)學(xué)上的價(jià)值(葉麗等, 2015)。DHA 俗稱(chēng)“腦黃金”, 是人體必需脂肪酸, 可以維持神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng), 促進(jìn)胎兒大腦發(fā)育及視網(wǎng)膜光感細(xì)胞的成熟, 在治療癌癥、炎癥和老年癡呆方面有明顯療效。EPA屬于Ω-3系列多不飽和脂肪酸, 可以降低膽固醇, 促進(jìn)人體內(nèi)飽和脂肪酸的代謝, 而且和 DHA共同作用可以防止血管壁上的垃圾堆積, 預(yù)防動(dòng)脈粥狀硬化(李荷芳等, 1999;石娟等, 2004)。在水產(chǎn)養(yǎng)殖上, DHA和EPA又是水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物幼體生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素, 可作為餌料飼養(yǎng)魚(yú)蝦貝類(lèi)( Watanabe et al, 1983; 高秀芝等,2014)。

海洋微藻脂肪酸的組成和含量不僅受自身遺傳因素的控制, 在很大程度上也受到環(huán)境因子的影響,在諸多環(huán)境效應(yīng)中, 溫度是一個(gè)非常重要的影響因素(李文權(quán)等, 2003; 石娟等, 2004; 蔣漢明等, 2005)。微藻細(xì)胞內(nèi)的各種生化反應(yīng), 酶的活性等都與溫度的調(diào)控直接有關(guān)。在適溫范圍內(nèi), 升溫可使微藻的生長(zhǎng)加快, 降溫使微藻的生長(zhǎng)速率降低。溫度過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)對(duì)這些生理活動(dòng)產(chǎn)生影響, 甚至威脅到微藻的存亡。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)多年研究, 已經(jīng)確定了部分藻株的油脂含量。本文從已確定藻株中選取了4株富油微藻, 分別為三株海洋微藻—三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum, CCMM 2012)、小球藻(Chlorella vulgaris, CCMM 4004)、微擬球藻(Nannochloropsis sp., CCMM 6004), 和一株淡水微藻—柵藻(Scenedesmus quadricauda, CCMM 4002), 研究了溫度對(duì)4株微藻的生長(zhǎng)、總脂含量及脂肪酸組成的影響, 旨在為規(guī)?；锰峁├碚撘罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種

本實(shí)驗(yàn)所采用藻種三角褐指藻(P. tricornutum,CCMM 2012), 小球藻(C. vulgaris, CCMM 4004), 微擬球藻(Nannochloropsis sp., CCMM 6004), 柵藻(S.quadricauda, CCMM 4002), 由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藻種庫(kù)提供。

1.2 培養(yǎng)條件

三角褐指藻、微擬球藻、小球藻三株海洋微藻用L1培養(yǎng)基培養(yǎng), 柵藻用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)(Thiansathit et al, 2015)。接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻種, 每1L海水/淡水里接種 100mL藻液, 初始密度分別為 2.2×106、4×105、 7.1×106和 5×105ind./mL, 培 養(yǎng) 瓶 置 于GXZ-280C-CO2-LED型光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 光暗周期為 12h/12h, 光照 20000lux, 光照培養(yǎng)箱腔體內(nèi)通入5%的CO2, 實(shí)驗(yàn)設(shè)定15、20、25oC三個(gè)溫度組, 每個(gè)溫度設(shè)置三個(gè)平行。

1.3 細(xì)胞生長(zhǎng)和單位體積油脂產(chǎn)率的測(cè)定和計(jì)算

取0、3、6、9和12天藻液, 采用血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定藻細(xì)胞密度, TD-700活體熒光計(jì)測(cè)定熒光值,PHS-3C型pH計(jì)測(cè)定pH。稱(chēng)重法測(cè)生物量(王付冬等,2010; 葉麗等, 2015), 藻液于 4oC 離心機(jī) 6000r/min離心10min, 蒸餾水洗滌2次, 離心、收集藻泥, -80oC冷凍干燥, 稱(chēng)重?？傊?(m2-m1)/m×100%計(jì)算,其中m為試樣質(zhì)量, g; m1為提脂瓶質(zhì)量, g; m2為提脂瓶與樣品所含總脂質(zhì)量, g; 單位體積油脂產(chǎn)率(mg/L/d)=(mt×Lt-m0×L0)/t×1000, 其中 mt為終生物量,g/L; Lt為收獲時(shí)總脂含量; m0為接種時(shí)干重, g/L; L0為接種時(shí)總脂含量; t為培養(yǎng)時(shí)間。

1.4 GC-MS樣品制備與測(cè)定

總脂抽提與測(cè)定(Bligh et al, 1959; 徐繼林等,2006; Berndmeyer et al, 2014): 干燥后的藻粉液氮研磨, 稱(chēng)取 10mg(m)藻粉, 用 3mL CH3OH-CHCl3(v∶v=2∶1)提取, 超聲 5min, 4oC離心 15min, 有機(jī)相倒入分液漏斗中, 殘?jiān)偌?mL CH3OH-CHCl3(v∶v =2∶1), 超聲, 離心, 重復(fù)提取直至提取物顏色很淺。合并有機(jī)相至分液漏斗中加 2.5mL CHCl3和 3mL 1%NaCl混勻, 靜置分層, 回收下層。再加 2.5mL CHCl3于原上層中再萃取, 重復(fù)兩次。下層液置于提脂瓶(m1)中, 氮吹至恒重, 于天平稱(chēng)量得到海藻總脂和提脂瓶的總重量(m2)。重量法計(jì)算總脂類(lèi)的含量w=(m2-m1)/m×100%。

脂肪酸甲酯的測(cè)定(李秀波等, 2010; 尹琳琳等,2010; 梁英等, 2013): 將提取的總脂置于10mL具塞試管中, 加入KOH-CH3OH溶液2.0mL, 置于75oC水浴環(huán)境下皂化60min, 皂化過(guò)程中每隔10min振蕩一次; 將皂化好的樣品取出冷卻至室溫后加入 HCl-CH3OH (v∶v =1∶9)溶液 2.0mL, 混勻, 在60oC水浴甲酯化 20min, 甲酯化過(guò)程中每隔 10min振蕩一次;將甲酯化好的樣品冷卻后加入飽和食鹽水3.0mL, 加入正己烷 1.0mL, 充分振蕩, 靜置, 取正己烷層用無(wú)水硫酸鈉脫水后進(jìn)行色譜分析。

色譜分析: 毛細(xì)管色譜柱HP-5MS(30m× 250cm×0.25um), 進(jìn)樣口溫度280oC, 起始溫度為50oC, 保持1min, 以 20oC/min升至 190oC, 再以 4oC/min升至240oC, 然后以 10oC/min升至 280oC, 維持 2min。不分流, 進(jìn)樣量1μL。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸(Sigma)保留時(shí)間的對(duì)比鑒別各脂肪酸組分, 外標(biāo)法計(jì)算各組分含量。

2 結(jié)果

2.1 溫度對(duì)四種微藻生長(zhǎng)的影響

在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中, 三角褐指藻在 25oC下細(xì)胞生長(zhǎng)最好。培養(yǎng)第3天和第6天時(shí), 三角褐指藻25oC下的藻密度分別為8.1×106和1.2×106ind./mL, 遠(yuǎn)高于15oC(4.4×106和 7.5×106ind./mL)和 20oC(3.5×106和5.2×106ind./mL)下的藻密度, 其中第 9天時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到最高值 1.3×106ind./mL, 幾乎為 15oC 和 25oC 下的細(xì)胞密度(7.7×106和 6.7×106ind./mL)的兩倍。培養(yǎng)到第12天時(shí), 微藻在 25oC下進(jìn)入生長(zhǎng)衰退期, 20oC下到達(dá)生長(zhǎng)平緩期, 15oC微藻繼續(xù)生長(zhǎng), 這說(shuō)明三角褐指藻在 25oC時(shí)可以快速生長(zhǎng)到達(dá)其生長(zhǎng)最大值,溫度較低時(shí)先緩慢生長(zhǎng)等其適應(yīng)低溫后再開(kāi)始快速生長(zhǎng)(圖1)。小球藻對(duì)溫度的適應(yīng)范圍較廣, 5—30oC均可正常生長(zhǎng), 20oC為最適宜生長(zhǎng)溫度。本實(shí)驗(yàn)在小球藻培養(yǎng)過(guò)程中, 前6天其生長(zhǎng)密度在15和20oC下約為2.8×106ind./mL; 第6天之后, 20oC下小球藻快速生長(zhǎng)到第 12天達(dá) 9.3×106ind./mL; 而 15oC時(shí)小球藻在第 9天開(kāi)始快速生長(zhǎng), 第 12天細(xì)胞密度為6.2×106ind./mL; 25oC 培養(yǎng)下的小球藻整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程均緩慢(圖 1); 微擬球藻在 25oC條件下生長(zhǎng)最快, 第9天時(shí)細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大值 4.8×106ind./mL, 遠(yuǎn)高于15oC(3.3×106ind./mL)和 20oC(2.7×106ind./mL)下的藻密度, 第9天之后細(xì)胞逐漸進(jìn)入衰亡期。前6天微擬球藻在20oC下的細(xì)胞密度要高于15oC的密度, 第 6天之后其在15oC下生長(zhǎng)加快, 到第9天和第12天時(shí)15oC 下的藻密度分別為 3.3×106和 3.6×106ind./mL,均高于20oC下的藻密度。本實(shí)驗(yàn)中微擬球藻在25oC下生長(zhǎng)最快, 第 12天已到衰退期, 根據(jù)生長(zhǎng)曲線走勢(shì), 微擬球藻在15oC和20oC下仍有可能繼續(xù)生長(zhǎng)(圖1); 柵藻在25oC高溫下更適宜生長(zhǎng), 此溫度下細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最大值為 2.5×106ind./mL。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中,柵藻在 15oC下細(xì)胞數(shù)量從剛開(kāi)始接種時(shí)的最低5.9×105ind./mL到第 9天時(shí)的最高值 1.2×106ind./mL,數(shù)量增長(zhǎng)不到兩倍。由此看出, 柵藻的最適生長(zhǎng)溫度為 25oC, 低于 20oC或高 30oC均不適合柵藻的生長(zhǎng)(圖 1)。

綜上所述, 三角褐指藻、微擬球藻和柵藻的最適生長(zhǎng)溫度為25oC, 小球藻的最適溫度為20oC。

圖1 溫度對(duì)三角褐指藻(P. tricornutum)、小球藻(C. vulgaris)、微擬球藻(Nannochloropsis sp.)和柵藻(S. quadricauda)生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of temperature on the growth of P. tricornutum, C. vulgaris, Nannochloropsis sp., and S. quadricauda

2.2 溫度對(duì)四種微藻油脂產(chǎn)率的影響

三角褐指藻在15oC和25oC下的油脂產(chǎn)率分別為2和 2.29mg/L/d, 其中在 20oC下油脂產(chǎn)率最多, 為2.94mg/L/d(圖2)。小球藻在15oC下油脂產(chǎn)率最少, 為2.78mg/L/d, 20oC和25oC下油脂產(chǎn)率相對(duì)較多, 分別為5.79和5.02mg/L/d(圖2)。微擬球藻20oC下油脂產(chǎn)率最少, 僅為1.85mg/L/d, 而15oC和25oC的油脂產(chǎn)率較多, 分別為 5.43和 6.45mg/L/d(圖 2)。柵藻在低溫15oC下油脂產(chǎn)率為2.38mg/L/d, 在20oC下最多, 為5.83mg/L/d, 25oC稍微有所降低, 為5.44mg/L/d(圖2)。

圖2 溫度對(duì)三角褐指藻(P. tricornutum)、小球藻(C.vulgaris)、微擬球藻(Nannochloropsis sp.)和柵藻(S.quadricauda)單位體積油脂產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of temperature on the oil yield per volume of P.tricornutum, C. Vulgaris, Nannochloropsis sp., and S.quadricauda

由上可知, 三角褐指藻、小球藻和柵藻在20oC下油脂產(chǎn)率最多, 而微擬球藻在25oC下油脂產(chǎn)率最多。

2.3 溫度對(duì)四種微藻C14—C18組分含量的影響

三角褐指藻在 15、20和 25oC三個(gè)溫度下的C14—C18組分含量分別為 44.45%、39.02%和46.27%(圖 3)。小球藻培養(yǎng)在 15、20和 25oC 下的C14—C18組分含量隨溫度升高而增多, 分別為22.08%、30.87%和 35.12%(圖 3)。微擬球藻在 15和20oC下的C14—C18組分含量分別為20.1%和40.26%,25oC下C14—C18組分含量最多, 達(dá)到71.23%(圖3)。柵藻在15、20和25oC的C14—C18組分含量分別為15.88%、23.88%和 25.36%(圖3)。

圖3 溫度對(duì)三角褐指藻(P. tricornutum)、小球藻(C.vulgaris)、微擬球藻(Nannochloropsis sp.)和柵藻(S.quadricauda)C14—C18組分含量的影響Fig.3 Effect of temperature on C14—C18 content for P.tricornutum, C. Vulgaris, Nannochloropsis sp., and S. quadricauda

所以, 四種微藻均在25oC下C14—C18組分最多。

2.4 溫度對(duì)四種微藻脂肪酸含量及組成的影響

在微藻中共檢出 17種主要脂肪酸, 其中飽和脂肪酸(SFA) 6種、單不飽和脂肪酸(MUFA) 4種、多不飽和脂肪酸(PUFA)7種, 其中多不飽和脂肪酸主要含有 C20:5(EPA)、C22:6(DHA)組分。

三角褐指藻細(xì)胞中飽和脂肪酸(SFA)在三個(gè)溫度下所占脂肪酸的比例分別為 13.44%、15.24%和15.89%, 單不飽和脂肪酸(MUFA)的百分比15oC下最多, 為 38.54%, 20oC和 25oC下分別為 21.98%和28.52%, 多不飽和脂肪酸(PUFA)不同溫度下的百分含量分別為24.94%、22.99%和21.43%。對(duì)三角褐指藻來(lái)說(shuō), 25oC最有利于飽和脂肪酸(SFA)的積累, 15 oC最有利于單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)的積累(圖4)。小球藻細(xì)胞中飽和脂肪酸(SFA)在三個(gè)溫度下所占比例分別為 21.25%、20.6%和20.01%, 單不飽和脂肪酸(MUFA)不同溫度下的百分含量為 8.05%、9.54%和 9.08%, 多不飽和脂肪酸(PUFA)的百分比為12.06%、18.46%和22.18%。對(duì)小球藻來(lái)說(shuō), 15oC最有利于飽和脂肪酸(SFA)的積累,20oC最有利于單不飽和脂肪酸(MUFA)的積累, 25oC最有利于多不飽和脂肪酸(PUFA)的積累(圖 5)。微擬球藻細(xì)胞中飽和脂肪酸(SFA)在三個(gè)溫度下所占比例15oC最少為9.28%、25oC最多為30.1%, 20oC為15.26%,單不飽和脂肪酸(MUFA)不同溫度下的百分含量為10.69%、24.26%和 34.98%, 多不飽和脂肪酸(PUFA)的百分比為 14.07%、23.18%和 32.55%。對(duì)微擬球藻來(lái)說(shuō), 25oC最有利于飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)的積累, 且含量都是隨著溫度的升高而增多(圖6)。柵藻細(xì)胞中飽和脂肪酸(SFA)在三個(gè)溫度下所占比例15oC最少為9.37%,20和25oC分別為13.18%和15.09%, 單不飽和脂肪酸(MUFA)不同溫度下的百分含量分別為 6.48%、9.21%和 9.19%, 多不飽和脂肪酸(PUFA)的百分比為10.25%、12.74%和14.1%。對(duì)柵藻來(lái)說(shuō), 25oC最有利于飽和脂肪酸(SFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)的積累,20oC最有利于單不飽和脂肪酸(MUFA)的積累(圖7)。

三角褐指藻在15、20和25oC三個(gè)溫度下的EPA含量分別為14.66%、12.32%和10.2%, DHA含量普遍較少, 分別為 1.81%、1.79%和 1.76%(圖 8)。小球藻在15、20和25oC下EPA和DHA含量普遍較少, 其中EPA含量分別為1.11%、1.14%和1.01%, DHA含量為1.39%、1.45%和1.28%(圖8)。微擬球藻的EPA含量隨溫度升高而增多, 分別為 6.22%、12.97%和21.29%, DHA含量分別為1.37%、1.42%和1.45%(圖8)。柵藻在15、20和25oC下的EPA和DHA含量都較少, EPA在三個(gè)溫度下含量為1.21%、1.15%和1.20%,DHA含量分別為1.51%、1.60%和1.47%(圖8)。

綜上所述, 對(duì)三角褐指藻來(lái)說(shuō), 25oC最有利于飽和脂肪酸(SFA)的積累, 15oC最有利于單不飽和脂肪酸(MUFA) 和多不飽和脂肪酸(PUFA)(包括 DHA 和EPA)的積累; 對(duì)小球藻來(lái)說(shuō), 15oC最有利于飽和脂肪酸(SFA)的積累, 20oC最有利于單不飽和脂肪酸(MUFA)的積累, 25oC最有利于多不飽和脂肪酸(PUFA) 的積累, EPA和DHA在三個(gè)溫度下含量普遍較少; 對(duì)微擬球藻來(lái)說(shuō), 25oC下飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)積累最多, DHA和EPA也都是在25oC下最多, 且含量都是隨著溫度的升高而增多; 對(duì)柵藻來(lái)說(shuō), 25oC最有利于飽和脂肪酸(SFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)的積累, 20oC最有利于單不飽和脂肪酸(MUFA)的積累,EPA和DHA含量都較少。

圖4 溫度對(duì)三角褐指藻(P. tricornutum)飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)百分含量的影響Fig.4 Effect of temperature on the percentages of saturated fatty acids(SFA), monounsaturated fatty acids (MUFA), and polyunsaturated fatty acids (PUFA) in P. tricornutum

圖5 溫度對(duì)小球藻(C. vulgaris)飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)百分含量的影響Fig.5 Effect of temperatures on the percentage of saturated fatty acids(SFA), monounsaturated fatty acids (MUFA), and polyunsaturated fatty acids (PUFA) in C. vulgaris

圖6 溫度對(duì)微擬球藻(Nannochloropsis sp.)飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)百分含量的影響Fig.6 Effect of temperature on the percentages of saturated fatty acids(SFA), monounsaturated fatty acids (MUFA), and polyunsaturated fatty acids (PUFA) in Nannochloropsis sp.

圖7 溫度對(duì)柵藻(S. quadricauda)飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)百分含量的影響Fig.7 Effect of temperature on the percentages of saturated fatty acids(SFA), monounsaturated fatty acids (MUFA), and polyunsaturated fatty acids (PUFA) in S. quadricauda

圖8 溫度對(duì)三角褐指藻(P. tricornutum)、小球藻(C. vulgaris)、微擬球藻(Nannochloropsis sp.)和柵藻(S. quadricauda)中C20:5(EPA)和C22:6(DHA)含量的影響Fig.8 Effect of temperature on C20:5(EPA) and C22:6(DHA) contents in P. tricornutum, Chlorella vulgaris, Nannochloropsis sp., and S. quadricauda

3 討論

微藻細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)、酶的活性等都對(duì)溫度特別敏感, 都與溫度的調(diào)控有著直接關(guān)系, 每一個(gè)微藻都有一個(gè)生長(zhǎng)繁殖最快, 代謝活動(dòng)最旺盛的最適溫度生長(zhǎng)范圍。通常, 在微藻能夠生長(zhǎng)的溫度范圍內(nèi),升高溫度可使微藻的生長(zhǎng)加快, 降低溫度使微藻的生長(zhǎng)速率降低。但是, 溫度過(guò)高(＞30oC)或過(guò)低(＜5oC)微藻幾乎都不生長(zhǎng), 甚至死亡。微藻中的脂質(zhì)含量與細(xì)胞內(nèi)ω-3脫氫酶的活性有關(guān), 溫度能夠調(diào)節(jié)ω-3脫氫酶的活性(石娟等, 2004)。在低溫脅迫條件下, 藻體內(nèi)的不飽和脂肪酸的含量會(huì)增加, 以維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性, 保證細(xì)胞活動(dòng)的正常進(jìn)行, 而飽和脂肪酸則與之相反( Renaud et al, 2002), 但并不是說(shuō)所有的微藻都符合這一規(guī)律。本文所研究的三角褐指藻與梁英等(2013)、臧正榮等(2015)和潘瑾等(2010)的研究結(jié)果均顯示在 20—25oC之間三角褐指藻生長(zhǎng)最旺盛, 生物量最多。三角褐指藻在 20oC下油脂產(chǎn)率最多, 在15oC下總脂含量最多, 而且這個(gè)溫度最有利于單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)(包括EPA和DHA)的積累, 而25oC時(shí)飽和脂肪酸(SFA)和C14—C18組分的脂肪酸含量最多, 這與前文的研究規(guī)律保持一致。蔣霞敏(2002)指出微擬球藻具有0—30oC廣泛的溫度適應(yīng)性, 本實(shí)驗(yàn)中25oC下的微擬球藻生長(zhǎng)最快, 生物量最大, 總脂含量和油脂產(chǎn)率也最多, 25oC下最有利于飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)的積累, 且含量都隨溫度的升高而增多, 顯然與上文所說(shuō)的規(guī)律并不完全相符, 不飽和脂肪酸并不是在低溫下含量最多。吳松(2008)和楊桂娟等(2009)等提出了小球藻在 5—30oC下均可正常生長(zhǎng), 25oC為最適宜生長(zhǎng)溫度。本研究中25oC下培養(yǎng)的小球藻整個(gè)過(guò)程生長(zhǎng)緩慢, 與前人所說(shuō)的小球藻的最適宜生長(zhǎng)溫度為 25oC這一結(jié)論相悖, 而且脂肪酸積累為 15oC飽和脂肪酸(SFA)的積累量最多, 20oC油脂產(chǎn)率最多且這個(gè)溫度下最有利于單不飽和脂肪酸(MUFA)、EPA和DHA兩種多不飽和脂肪酸的積累, 25oC最有利于C14—C18的脂肪酸含量的積累。鄭忠明等(2008)和晁建穎等(2011)的研究結(jié)果顯示低于20oC或高于30oC均不適合柵藻的生長(zhǎng), 本文研究發(fā)現(xiàn)柵藻 20oC的油脂產(chǎn)率最多, 柵藻的最適生長(zhǎng)溫度為25oC。柵藻各個(gè)培養(yǎng)時(shí)期也均是 25oC高溫下油脂含量最多, 其中飽和脂肪酸(SFA)、多不飽和脂肪酸(PUFA)和 C14—C18組分含量最多。小球藻和柵藻的研究結(jié)果與前文的油脂積累規(guī)律不符, 這可能是所采用的實(shí)驗(yàn)條件不同, 本實(shí)驗(yàn)采用了高光照強(qiáng)度和通入CO2控制pH等手段, 目的是縮短微藻的生長(zhǎng)周期, 使其盡快達(dá)到生長(zhǎng)平緩期, 這無(wú)疑對(duì)微藻細(xì)胞在數(shù)量上的增多是有益的, 但對(duì)于藻細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)的影響則可能導(dǎo)致不一樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

海洋微藻的脂肪酸組成及含量受自身遺傳因素的影響, 不僅不同種類(lèi)微藻的脂肪酸組成差別很大,甚至同一種類(lèi)不同品系之間也存在很大的差別。同時(shí)也會(huì)因?yàn)榄h(huán)境因素的改變而變化, 不同藻綱的脂肪酸組成存在一定的特點(diǎn)(陳百靈, 2011; 吳偉偉,2012)。硅藻綱(Bacillariophyceae)的主要脂肪酸為C14:0、C16:0、C16:1、C18:2、C18:1、C20:5(EPA)和 C22:6(DHA), 以上 7種脂肪酸總含量可以占到總脂肪酸的一半以上。統(tǒng)計(jì)分析表明, 正常生長(zhǎng)條件下,硅藻的平均油脂含量為 22.7%, 而脅迫條件下, 可以實(shí)現(xiàn)總脂含量保持在44.6%(Hu et al, 2006)。綠藻綱(Chlorophyceae)的主要脂肪酸組成為C14:1、C16:0、C16:1、C18:3、C18:2、C18:1、C18:0、C19:0 和C20:5(EPA), 單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量較高, 一般主要是C16和C18類(lèi)。數(shù)據(jù)表明, 含油綠藻平均總脂含量為25.5%, 當(dāng)綠藻細(xì)胞遭受不利的培養(yǎng)條件, 如光氧化壓力或營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí), 脂質(zhì)含量會(huì)大大增加(雙倍或三倍)。平均來(lái)說(shuō), 含油綠藻在壓力條件下生長(zhǎng)獲得的總脂質(zhì)含量為45.7%(Hu et al, 2006)。真眼點(diǎn)藻綱(Eustigmatophyceae)的主要脂肪酸組成為C14:0、C16:0、C16:1、C18:3、C18:1 和 C20:5(EPA),尤其以C16:0、C16:1和C20:5(EPA)含量最多。

本文四株微藻中三角褐指藻屬于硅藻綱, 小球藻和柵藻屬于綠藻綱, 微擬球藻屬于真眼點(diǎn)藻綱, 溫度對(duì)不同類(lèi)別微藻的脂肪酸含量影響不同。微藻中脂肪酸的合成比較復(fù)雜, 主要通過(guò)乙酰輔酶 A羧化酶和脂肪酸合成酶兩個(gè)酶系的反應(yīng)進(jìn)行, 一般有ω-3和ω-6兩條合成途徑, 兩條途徑的產(chǎn)物均以二酯酰甘油的形式轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體, 被糖基化為相應(yīng)的單糖基二酯酞甘油。三角褐指藻的脂肪酸含量較高的是C16:1和C20:5, 15oC低溫更有利于C20:5(EPA)的生成, 溫度對(duì) C22:6(DHA)影響不大, 這與李文權(quán)等(2003)的研究結(jié)果相一致。三角褐指藻的合成最有可能的是在Δ5、Δ6、Δ9和Δ12去飽和酶共同催化下結(jié)合兩種途徑合成(Domergue et al, 2002, 2003)。小球藻的脂肪酸含量較高的是C19:0, 25oC的C14—C18組分最多, 溫度對(duì) C20:5(EPA)、C22:6(DHA)的含量影響不大, 與Converti等(2009)的研究結(jié)果一致。小球藻的脂肪酸是在ω-3、Δ12和Δ15去飽和酶催化下完成的, 以ω-3途徑為主(Koushirou et al, 2002)。微擬球藻的脂肪酸含量較高的是 C16:1和 C20:5, 高溫更有利于C20:5(EPA) 和 C14—C18組分的生成, 且含量與溫度呈正相關(guān), 溫度對(duì) C22:6(DHA)影響不大, 微擬球藻的脂肪酸是在只有ω-3去飽和酶催化下完成的, 以ω-3途徑為主。柵藻的脂肪酸含量較高的是C19:0, 溫度對(duì) C20:5(EPA)、C22:6(DHA)的含量影響不大, 高溫更有利于C14—C18組分的生成, 柵藻與綠藻同屬綠藻綱, 脂肪酸生成規(guī)律也相似。

4 結(jié)論

(1) 三角褐指藻、微擬球藻和柵藻的最適生長(zhǎng)溫度為25oC, 小球藻的最適溫度為20oC。

(2) 三角褐指藻、小球藻、微擬球藻三株微藻均是在25oC下生物量最多, 分別為0.32、0.35和0.33g,柵藻在20oC下生物量最多, 為0.15g。

(3) 三角褐指藻在 15oC下總脂含量最多。小球藻培養(yǎng)溫度越高, 總脂含量越多。微擬球藻在 25oC高溫下油脂量最多。柵藻各個(gè)培養(yǎng)時(shí)期均為高溫下油脂含量最多。

(4) 三角褐指藻、小球藻和柵藻在 20oC下油脂產(chǎn)率最多, 微擬球藻在 25oC下油脂產(chǎn)率最多。四種微藻均是在25oC下C14—C18組分最多。

(5) 三角褐指藻25oC下SFA和C14—C18組分最多, 15oC下MUFA和PUFA(包括DHA和EPA)含量最多。小球藻15oC下SFA最多, 20oC下MUFA最多, 25oC下PUFA和C14—C18組分最多, EPA和DHA在三個(gè)溫度下含量普遍較少。微擬球藻25oC下SFA、MUFA和PUFA積累最多, C14—C18組分、DHA和EPA也最多, 且含量都隨溫度的升高而增加。柵藻 25oC下SFA、PUFA和 C14—C18組分含量最多, 在20oC下最有利于MUFA的積累, EPA和DHA含量均較少。

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