朱 歡 宋會銀, 王清華, 胡愈炘, 胡征宇 劉國祥①

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所中國科學(xué)院藻類生物學(xué)重點實驗室 武漢 430072 2. 中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室 武漢 430072 3. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

蟲綠藻屬(Zoochlorella)是指同淡水原生動物、無脊椎動物共生的一類球狀綠藻(coccoid green algae)(Rajevi? et al, 2015)。該屬是 Brandt依據(jù)在多種原生動物和無脊椎動物體內(nèi)分離且能夠營自由生活的多株球狀綠藻標(biāo)本而建立, Brandt同時指出該屬藻類與小球藻屬(Chlorella)的主要區(qū)別在于能夠與淡水原生動物和無脊椎動物共生(Letsch et al, 2009)。Beijerinck(1890)認(rèn)為蟲綠藻屬在自由生活狀態(tài)下的形態(tài)和繁殖方式均與小球藻相似而將蟲綠藻屬中的種均歸入小球藻屬。隨著人們對淡水原生動物和無脊椎動物共生藻研究的展開, 越來越多的形態(tài)與“小球藻”相似的(Chlorella-like algae)種類被歸入小球藻科(Chlorellaceae)或蟲綠藻科(Zoochlorellaceae)(Fott et al, 1969; Lee et al, 1982; Kessler et al, 1990; Holweg et al, 1994; Pr?schold et al, 2011; Rajevi? et al, 2015)。同時, 不斷積累的形態(tài)學(xué)和植物生理學(xué)方面的證據(jù)表明蟲綠藻屬應(yīng)該被作為小球藻屬的異名處理(Fott et al, 1969; Vinayakumar et al, 1975; Kessler, 1976;Reisser, 1984; Douglas et al, 1986; Kessler et al, 1990;Kessler et al, 1992; Takeda, 1995)。1999年修訂的國際植物命名法規(guī)更正了小球藻屬和蟲綠藻屬, 認(rèn)為二者是異名; 并依據(jù)優(yōu)先權(quán)原則采用小球藻屬和小球藻科(Greuter et al, 2000)。

分子生物學(xué)同形態(tài)學(xué)的結(jié)合使得人們對小球藻科的系統(tǒng)分類學(xué)有了進(jìn)一步的認(rèn)識(Huss et al, 1990;Henley et al, 2004; Müller et al, 2005; Darienko et al,2010; Luo et al, 2010; Bock et al, 2011; Pr?schold et al,2011; Lee et al, 2012; Krienitz et al, 2015; Rajevi? et al,2015)。由于小球藻科中的種類形態(tài)單一, 傳統(tǒng)的僅僅依據(jù)形態(tài)學(xué)證據(jù)而建立的種類被分子系統(tǒng)學(xué)和其它的分類學(xué)手段(如超微結(jié)構(gòu)、病毒抗性等)而更正(Krienitz et al, 2003; Henley et al, 2004; Pr?schold et al, 2007; Luo et al, 2010; Bock et al, 2011; Lee et al,2012; Leliaert et al, 2012; Krienitz et al, 2012; Krienitz et al, 2015)。近年來球狀綠藻類群中新的分類學(xué)修訂以及成立的新種屬更多地依據(jù)分子系統(tǒng)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的證據(jù)。在小球藻科中, 分子系統(tǒng)發(fā)育和 ITS2二級結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是區(qū)分不同屬種最為有效的手段(Pr?schold et al, 2007; Bock et al, 2011; Pr?schold et al,2011)。越來越多的分子系統(tǒng)發(fā)育研究表明該科模式屬小球藻屬是一個多系類群。之前被描述為小球藻屬或蟲綠藻屬的種類不斷被重新描述和定義, 例如,Chlorella variabilis被認(rèn)為同Chlorella paramaecii異名; 微芒藻(Micractinium conductrix)與 Zoochlorella conductrix和Micractinium reisseri異名。同時, 蟲綠藻屬的種類被歸入了多個屬中, 如小球藻屬(Chlorella)、膠球藻屬(Coccomyxa)、微芒藻屬(Micractinium)、索囊藻屬(Choricystis)等(Pr?schold et al, 2011; Krienitz et al, 2015; Rajevi? et al, 2015)。

Fott詳細(xì)比較了多個膠球藻屬的種的形態(tài)之后認(rèn)為, 小膠球藻(Coccomyxa minor)等與模式種Coccomyxa dispar在細(xì)胞大小和似親孢子形成過程方面不同, 建立索囊藻屬(Fott, 1976)。最近的基于rDNA序列的分子系統(tǒng)發(fā)育和 ITS2二級結(jié)構(gòu)預(yù)測研究證實索囊藻屬為一個單系類群, 歸屬于共球藻綱膠球藻科(Darienko et al, 2015; Borowitzka, 2016)。然而基于葉綠體 rbcL序列構(gòu)建的進(jìn)化分析顯示索囊藻屬雖然為一個單系類群, 但并未與膠球藻科聚于一支(Kulichová et al, 2014)。由此可見, 索囊藻屬的單系性已為多數(shù)分類學(xué)家所接受, 然而其具體的系統(tǒng)發(fā)育位置仍未有定論。

已有文獻(xiàn)資料顯示索囊藻模式種的分類歷史最早可追溯到 Brandt(1881)描述的寄生蟲綠藻(Zoochlorella parasitic)(Guiry et al, 2016)。Bejerinck(1890)將該種歸入小球藻屬并更名為寄生小球藻(Chlorella parasitica)。Skuja(1948)根據(jù)該種的繁殖特征將之歸入膠球藻屬, 并更名為小膠球藻(Coccomyxa minor)。Fott(1976)詳盡地研究了膠球藻屬和偽膠球藻屬, 并認(rèn)為小膠球藻與膠球藻屬的副模式種 Coccomyxa confluens不同, 將之移出膠球藻屬并以此成立索囊藻屬。Pr?schold等(2011)對兩株與針海綿內(nèi)共生的球狀綠藻進(jìn)行了較為詳盡的分子特征鑒定, 認(rèn)為小膠球藻與寄生索囊藻和小索囊藻異名, 并重新指認(rèn)寄生索囊藻為該屬模式種。此外, 在有記錄的索囊藻屬的 9個種中, 僅有其模式種(寄生索囊藻)有較為詳盡地形態(tài)觀察和分子特征描述(Guiry et al, 2016)。

綠色淡水海綿(green freshwater sponge)是與綠藻共生而呈現(xiàn)出翠綠色的淡水針海綿(Skelton et al,2013)。在形成的共生體中, 海綿細(xì)胞吞噬了大量的球狀綠藻但并未消化這些藻類, 而是與之共生(Johnson,2011)。在共生體中, 海綿提供給藻類生長繁殖必須的營養(yǎng), 藻類將多余的光合產(chǎn)物提供給海綿(Johnson,2011)。然而國內(nèi)目前對淡水海綿的研究較少, 已有的研究多集中在物種的描述與生態(tài)調(diào)查方面。對綠色海綿共生藻類的研究仍舊處于空白狀態(tài)。2015年, 我們在西藏錯鄂的湖底和武漢紫陽湖岸邊采集到了兩株綠色海綿。在室內(nèi)分析樣品時我們發(fā)現(xiàn)這兩株綠色海綿的共生綠藻均為球狀綠藻。通過形態(tài)觀察、分子系統(tǒng)發(fā)育分析和 ITS2二級結(jié)構(gòu)比較, 我們將此兩株海綿的共生藻鑒定為寄生索囊藻, 此屬為在中國的首次報道。

1 材料與方法

1.1 材料采集和形態(tài)觀察

兩株海綿分別采集自西藏錯鄂(采集人朱歡, 采集時間 2015 年 6 月 2 日, 采集地點 88°76′97″E,31°60′57″N, 標(biāo)本編號為 TB15158)和湖北武漢的紫陽湖(采集人劉國祥, 采集時間2015年7月15日, 采集 地 點 114°30′42″E, 30°53′05″N, 標(biāo) 本 編 號 為HB15002。采集后的標(biāo)本一部分使用福爾馬林加10%的甘油固定用于形態(tài)觀察; 另一部分使用無水乙醇固定用于DNA提取。

在體視鏡(KL1500 LCD; Zeiss, G?ttingen, Germany)剝離海綿標(biāo)本, 吸取浸出的藻液制作臨時裝片在顯微鏡(DM5000B, Leica, Wetzlar, Germany)下使用微分干涉(Differential Interference Contrast, DIC)模式觀察形態(tài)結(jié)構(gòu), 圖像獲取使用Leica DFC320 CCD。

1.2 DNA提取, PCR擴(kuò)增及測序

體視鏡下使用磷酸鹽緩沖液(PBS, pH=7.0)清洗剝離的海綿。將清洗后的植物體放入加入 1.5mL CTAB緩沖液[2%CTAB, 0.1mol/L Tris-HCl(pH=8.0),1.4mol/L NaCl, 10mmol/L EDTA, 1.5% β-巰基乙醇]和0.5mL直徑0.5mm的玻璃破碎珠的2mL凍存管中。使用mini-beadbeater(Model 3110BX, Biospec Products,Bartlesville, Oklahoma, USA)振蕩破碎2min。后置于65°C 溫浴 30min。使用等體積的酚?氯仿?異戊醇(25?24?1)液抽提 1 次。轉(zhuǎn)移上清至新的 EP 管中, 加入終濃度為10μg/mL的RNAase, 37°C溫浴25min。使用氯仿?異戊醇液(24?1)抽提一次。轉(zhuǎn)移上清, 使用2/3倍體積的異丙醇沉淀DNA。離心后棄上清, 70%的乙醇清洗沉淀 2次。常溫干燥沉淀后溶于 20μL的 TE緩沖液中。

使用 Honda等(1999)中的引物和條件擴(kuò)增 18S rDNA序列; 使用 Zechman(2003)中的引物 rbcLQ和rbcLB擴(kuò)增rbcL序列; 使用Hayakawa等(2012)中的引物和條件擴(kuò)增ITS rDNA序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后, 在紫外透射臺(CUV30A, 上海勤翔)上切取目的條帶, 使用膠回收試劑盒(E.Z.N.A. Gel Extraction Kit Omega Bio-Tek, 美國)純化回收純化 PCR產(chǎn)物。純化后的 PCR產(chǎn)物與pMD18-T(寶生物, 大連, 中國)載體連接, 轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α中, 以通用引物(M13)為測序引物測序(擎科生物, 武漢, 中國)。測序后的序列上傳至GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

將本研究獲取的序列從 GenBank上檢索比對,并下載近緣序列。使用mafft7.2(Katoh et al, 2013)進(jìn)行序列比對。使用Bioeditv7.2(Hall, 2013)修正比對后的序列。校正后的數(shù)據(jù)使用 MEGA7.0(Kumar et al,2016)和DAMBE5.0(Xia, 2013)進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量評估。使用jModeltest2.1(Darriba et al, 2012)進(jìn)行最適模型評估。進(jìn)化樹的構(gòu)建采用最大似然法和貝葉斯法。最大似然法使用軟件為RAXML8.0(Stamatakis, 2014), 貝葉斯法使用MrBayes3.2 (Ronquist et al, 2012)。

使用ITS2 database數(shù)據(jù)庫對獲取的ITS區(qū)域進(jìn)行了精確注釋(Ankenbrand et al, 2015)。使用數(shù)據(jù)庫中已有的ITS2二級結(jié)構(gòu)作為預(yù)測模型對本研究中獲取的ITS2二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(Ankenbrand et al, 2015)。預(yù)測的模型使用4sale和VaRNA3.1軟件進(jìn)行比對注釋(Seibel et al, 2006; Darty et al, 2009)。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)觀察

一種淡水針海綿(Spongillidae sp.)(圖1a、1b, 圖2a、2c)

本研究中共采集到兩株海綿標(biāo)本。其中西藏標(biāo)本附著在湖底約4.0—7.0m處深的輪藻植物上, 海綿整體呈翠綠色, 緣管狀, 緣管偶有分叉, 寬 0.5—1.2cm(圖1a、1b); 硅質(zhì)骨針單軸、中部縱向具一條不明顯的愈合縫, 長 150—500μm, 多 250—350μm(圖2a)。湖北標(biāo)本附著在湖岸基質(zhì)表面, 暗綠色, 整體呈墊狀、無緣管狀凸起; 骨針硅質(zhì), 單軸、中部縱向具一條不明顯的愈合縫, 長 150—450μm, 多 300μm 左右(圖 2c)。

由于標(biāo)本采集后我們立即使用甲醛和無水乙醇分別進(jìn)行了固定, 體視鏡和顯微鏡下并未觀察到完整的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。這可能主要是因為構(gòu)成淡水針海綿的幾類細(xì)胞(扁平細(xì)胞、領(lǐng)細(xì)胞、芒狀細(xì)胞、變形細(xì)胞)在甲醛固定后極易破碎, 只有硅質(zhì)骨針較為完整地保持了原本的形態(tài)。因此, 這也給標(biāo)本的物種鑒定帶來了一定困難。這也是我們將這兩株海綿僅鑒定到科的主要原因。此外, 索囊藻均共生在一個形狀不規(guī)則的囊球狀細(xì)胞內(nèi), 這與國外報道的淡水針海綿的變形細(xì)胞一般會內(nèi)共生大量球狀綠藻的描述一致。

圖1 采集自錯鄂的淡水海綿, 外觀呈翠綠色的緣管狀Fig.1 The freshwater sponge collected from Nagtsang Tso, with an olive-green tubular in morphology

索囊藻屬

Choricystis (Skuja) Fott, 1976

Fott, B. (1976). Choricystis, eine neue Gattung der Chlorococcales (Chlorophyceae). Archiv für Hydrobiologie Supplement Algological Studies 49:382—388.

Holotype species: Choricystis parasitica (K.Brandt) Pr?schold & Darienko 2011

細(xì)胞橢圓形、紡錘形或長卵形, 橄欖綠色; 細(xì)胞壁光滑, 無膠被; 具一個側(cè)位片狀色素體, 無蛋白核;細(xì)胞長約 1.2—2.8μm, 寬約0.8—1.5μm。無性繁殖以產(chǎn)生似親孢子為主, 通常2或4個靜孢子。該屬內(nèi)不同種的區(qū)分主要依靠營養(yǎng)細(xì)胞的大小和形態(tài)。

該屬為中國新紀(jì)錄屬。

寄生索囊藻(圖2c—g)

Choricystis parasitica (K. Brandt) Pr?schold &Darienko 2011.

Pr?schold T, Darienko T, Silva P C, Reisser W &Krienitz L (2011). The systematics of Zoochlorella revisited employing an integrative approach.Environmental Microbiology 13(2): 350—364.

Homotypic Synonyms: Zoochlorella parasitica K Brandt 1881; Chlorella parasitica (K. Brandt)Beijerinck 1890.

Heterotypic Synonyms: Coccomyxa minor Skuja 1948; Choricystis minor (Skuja) Fott 1976; Choricystis minor var. gallica (Bourrelly) Komarek 1979.

細(xì)胞橢圓形、紡錘形或長卵形, 橄欖綠色; 細(xì)胞壁光滑, 無膠被; 具一個側(cè)位片狀色素體, 無蛋白核;成熟老化的營養(yǎng)細(xì)胞色素體偶有不明顯的分瓣; 細(xì)胞壁薄; 細(xì)胞長 1.2—2.8μm, 寬 0.8—1.5μm(圖2e—g)。通常十幾個至數(shù)十個內(nèi)共生在一個海綿變形細(xì)胞內(nèi)(圖2c—d)。無性繁殖以產(chǎn)生兩個似親孢子為主。

該種為中國新紀(jì)錄種。

圖2 本研究中采集的淡水針海綿的骨針和共生索囊藻形態(tài)特征Fig.2 The morphology of spicules and Chorisystis cells

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究中獲得的兩條海綿的 18S rDNA在GenBank上比對后, 下載獲得了包含 38條序列的矩陣, 其中 Svenzea為外類群。比對后的序列矩陣長1594bp, 其中可變位點 111個, 簡約信息位點 94個,單態(tài)位點17個; 矩陣中四種堿基TCAG的平均含量分別為25.4%、20.8%、25.3%和28.5%。飽和指數(shù)分析顯示序列矩陣并未飽和(Iss=0.077＜Issc=0.795), 可用于進(jìn)化分析。本研究中共獲取了4條索囊藻的18S rDNA序列, 其中西藏標(biāo)本和湖北標(biāo)本各兩條。下載獲得了包含主要共球藻綱支系的序列約 75條, 其中以衣藻(Chlamydomonas)和團(tuán)藻(Volvox)為外類群。比對校正后的序列長度為1594bp, 其中可變位點523個,簡約信息位點336個, 單態(tài)位點187個; 矩陣中四種堿基TCAG的平均含量分別為25.4%、21.9%、24.4%和 28.2%。飽和指數(shù)分析顯示序列矩陣并未飽和(Iss=0.054＜Issc=0.791), 可用于進(jìn)化分析。本研究共獲得了 4條索囊藻的 rbcL克隆序列, 其中兩條擴(kuò)增自西藏標(biāo)本兩條擴(kuò)增自湖北標(biāo)本。比對校正后的序列矩陣共包含 60條序列, 其中以兩條團(tuán)藻序列為外類群。矩陣長 937bp, 可變位點 427個, 簡約信息位點400個, 單態(tài)位點27個; 矩陣中四種堿基TCAG的平均含量分別為29.9%、19.5%、28.9%和21.7%。飽和指數(shù)分析顯示序列矩陣并未飽和(Iss=0.194＜Issc=0.739), 可用于進(jìn)化分析。

本研究共得到8條索囊藻的ITS序列, 精確注釋后得到的ITS2長度均為228bp, 序列與數(shù)據(jù)庫中的兩條寄生索囊藻(GenBank numbers: FN298929和FN298930)注釋后的長度一致。在數(shù)據(jù)庫中(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/)應(yīng)用已有的膠球藻模型進(jìn)行預(yù)測, 預(yù)測得到的 8條 ITS2二級結(jié)構(gòu)模型均具有四條臂(Helix), 其中Helix-I長度為32bp,Helix-II長度為27bp, Helix-III長度為81bp, Helix-IV長度為8bp(圖3)。本研究中預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)與數(shù)據(jù)庫中的寄生索囊藻的二級結(jié)構(gòu)完全一致, 基本證明本研究中得到的兩株索囊藻均為寄生索囊藻。

在構(gòu)建的六條進(jìn)化樹中, 每個矩陣運用最大似然法和貝葉斯法得到的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致。在使用18S rDNA序列構(gòu)建的針海綿的進(jìn)化樹中, 本研究采集的兩株標(biāo)本與針海綿科中的其它種類聚于一起,該支的支持值和后驗概率分別為100和1.00, 證實了這兩株為淡水針海綿科中的種類(圖 4)。但由于在針海綿科中, 各個屬的分類問題較為復(fù)雜, 在將淡水針海綿科中的分類系統(tǒng)學(xué)問題解決之前僅通過 18S rDNA序列并不能將標(biāo)本鑒定到屬。然而這一問題并不是本研究中的焦點, 在此不展開描述。

圖3 基于本研究獲得的8條索囊藻克隆序列預(yù)測的ITS2二級結(jié)構(gòu)。共有四條臂, 分別長為32bp、27bp、81bp和8bpFig.3 The consensus secondary structure of ITS2 inferred from eight sequences clones. There are four Helix in length of 32bp, 27bp,81bp, and 8bp, respectively

圖4 基于18S rDNA序列構(gòu)建的淡水針海綿的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 The phylogram inferred from18S rDNA sequences of Spongillidae

本研究共得到索囊藻18S rDNA序列4條、rbcL cpDNA序列4條?；?8S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示本研究中的兩株索囊藻與數(shù)據(jù)庫中的索囊藻聚于一支, 與葡萄藻(Botryococcus)、膠球藻(Coccomyxa)共同構(gòu)成了共球藻綱的CBC分支, 其自展支持值和后驗概率分別為58和0.84。在CBC分支中, 本研究所用到的索囊藻序列均聚于一支, 其自展支持值和后驗概率分別為96和1.00(圖5)。本研究中,依據(jù) rbcL序列進(jìn)行的進(jìn)化分析顯示索囊藻均聚于一支, 其自展支持值和后驗概率分別為 100和 1.00(圖6)。然而, 基于rbcL的進(jìn)化分析得出的共球藻綱的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與基于18S rDNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)有較大差異。在rbcL序列構(gòu)建的進(jìn)化樹中, 索囊藻單獨聚于一支與其它的共球藻綱的支系(諸如小球藻目、渡邊分支、共球藻目和溪菜分支等)較早地分離; 但在 18S rDNA序列構(gòu)建的進(jìn)化樹中, 索囊藻與膠球藻和葡萄藻聚于一支。

圖5 基于共球藻綱18S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 The phylogram based on 18S rDNA sequences of Trebouxiaphyceae

圖6 基于共球藻綱rbcL cpDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 The phylogram based on rbcL rDNA sequences of Trebouxiaphyceae

3 討論

在球狀綠藻類群中, 僅僅依靠顯微形態(tài)來進(jìn)行屬種水平上的鑒定具有很大的缺陷和局限性, ITS2二級結(jié)構(gòu)對于解決種屬水平的球狀綠藻較為有效(Coleman, 2007; Luo et al, 2010; Buchheim et al, 2011;Pr?schold et al, 2011; Friedl et al, 2012; Krienitz et al,2012; Leliaert et al, 2012)。這一觀點在本研究中得到證實。由于膠球藻科中的各個屬在顯微形態(tài)下基本差別不大, 對該科種類的鑒定往往依靠繁殖生物學(xué)的特征和超微結(jié)構(gòu)特征以及分子特征。因此, 我們認(rèn)為索囊藻屬中其它各種的系統(tǒng)發(fā)育位置仍舊需要進(jìn)一步的研究。

在共球藻綱中, 各個支系的系統(tǒng)發(fā)育位置仍舊充滿爭議(Smith et al, 2011; Leliaert et al, 2012; Marin,2012; Jeong et al, 2014; Lemieux et al, 2014; Orsini et al, 2016)。同時, 部分研究顯示共球藻綱的并不是一個單系類群(Fu?íková et al, 2014; Sun et al, 2016)。這些看似矛盾的結(jié)論可能主要是由基于核基因分子標(biāo)記得出的進(jìn)化分析結(jié)論與基于細(xì)胞器(質(zhì)體或線粒體)基因組(或分子標(biāo)記)不一致造成的(Pr?schold et al,2007; Leliaert et al, 2012)。本研究中也出現(xiàn)了這一現(xiàn)象, 即基于18S rDNA和rbcL cpDNA得出的共球藻綱的進(jìn)化樹具有不一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。有學(xué)者認(rèn)為這一問題的根源在于質(zhì)體基因與核基因所面臨的不同的進(jìn)化壓力(Smith et al, 2011; Jeong et al, 2014; Orsini et al, 2016)。總體而言, 我們推測共球藻綱的多數(shù)類群或支系其核基因進(jìn)化速率與葉綠體基因的進(jìn)化速率維持著相對穩(wěn)定; 然而在一些特殊類群中, 如氣生性的或內(nèi)共生性的球狀綠藻, 它們的特殊生境使得它們的葉綠體基因或核基因面臨更大的進(jìn)化壓力, 進(jìn)而表現(xiàn)出與二者之間有較大的進(jìn)化速率。這表現(xiàn)在進(jìn)化分析上就可能得出核基因與葉綠體基因不一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。在本研究中的兩株索囊藻均為內(nèi)共生性的,同時本研究中所用有詳盡生境描述的索囊藻序列也均為內(nèi)共生性。這表明針海綿與索囊藻可能是專一性共生。同時也在一定程度上支持了上述觀點, 即針海綿將索囊藻吞噬牧植后其葉綠體基因或核基因表達(dá)速率可能升高, 進(jìn)而表現(xiàn)為與其它共球藻綱支系不同的進(jìn)化速率; 在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上(基于核基因和質(zhì)體基因的進(jìn)化分析)這有可能表現(xiàn)為索囊藻處在不同的系統(tǒng)發(fā)育位置。

對索囊藻屬進(jìn)行系統(tǒng)的分類學(xué)研究比較困難,這主要是因為索囊藻屬內(nèi)的物種采集較為困難。最近報道的索囊藻均為內(nèi)共生性的種類, 且通過 ITS2二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示均為寄生索囊藻。可以說, 目前為止經(jīng)過較為系統(tǒng)鑒定(包含有相應(yīng)分子標(biāo)記如 18S 和ITS rDNA、rbcL和tufA cpDNA等)的索囊藻僅有其模式種寄生索囊藻。已有描述的索囊藻屬的種類在經(jīng)過分子鑒定之后其分類可能會有進(jìn)一步的革新?？傮w來講, 綠藻門中包括索囊藻在內(nèi)的球狀綠藻的分類系統(tǒng)正處在急速的變革中。先前根據(jù)形態(tài)性狀建立的種屬需要較為全面的分子系統(tǒng)發(fā)育驗證, 進(jìn)而確定其系統(tǒng)發(fā)育位置; 此外, 球狀綠藻存在較大的隱性多樣性, 大量標(biāo)本的采集和多種鑒定手段結(jié)合的多相方法對于解決這個問題可能較為有效。

致謝 樣品采集過程中得到了中國科學(xué)院水生生物研究所何德奎博士、崔永德博士、賈銀濤博士和熊雄博士的鼎力幫助, 在此表示感謝。

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