唐古生，　柳　敏，　胡曉霞，　高　磊，　楊建民，　王健民

(上海市長海醫(yī)院血液內(nèi)科，上海 200433)

慢性淋巴細胞白血病CD5漏檢臨床案例分析及對策

唐古生，柳敏，胡曉霞，高磊，楊建民，王健民

(上海市長海醫(yī)院血液內(nèi)科，上海 200433)

摘要：目的分析不同熒光素標記抗體對慢性淋巴細胞白血病(CLL)B細胞表面CD5檢測結(jié)果差異及其對臨床診斷的影響。方法采用流式細胞儀檢測3例CD5表達強度不同的慢性淋巴細胞白血病(CLL)患者的免疫表型，采用SYSMEX XE2100 全自動血液分析儀檢測血常規(guī)；以1例急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)患者作為陰性對照。結(jié)果采用異硫氰酸熒光素(FITC)標記抗體檢測4例患者骨髓異常B淋巴細胞CD5表達，CD5陽性細胞未見獨立成群，陽性細胞比例分別為47.1%、17.7%、6.7%和7.9%；以≥20%為標準，僅病例1陽性。以PE-Cy7熒光素標記抗體重新檢測，病例1和2的CD5陽性細胞獨立成群，病例3 CD5表達呈連續(xù)表達模式，陽性細胞比例分別上升至91.1%、70.3%和38.2%。而對照病例4(B-ALL患者)2次檢測CD5比例均為陰性。病例1、2、3符合典型CLL免疫表型。結(jié)論CLL患者B細胞表面常異常表達CD5，但其表達強度顯著低于T細胞表面CD5表達。采用弱熒光素標記抗體檢測B細胞表面CD5表達，會出現(xiàn)漏檢進而影響臨床診斷。對弱表達抗原選擇合適的熒光素標記，并進行驗證和比對確定其準確性，是正確提供疾病免疫表型的重要保障。

關(guān)鍵詞：CD5；免疫表型；慢性淋巴細胞性白血?。涣魇郊毎麅x；漏檢

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)01-0021-05R446.11

文獻標志碼：碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.01.006

Abstract:ObjectiveTo analyze the variation of CD5 caused by different fluorescein-labeled antibodies on B cells in patients with chronic lymphocytic leukemia(CLL) and the influence on clinical diagnosis. MethodsFlow cytometry and SYSMEX XE2100 automated hematology analyzer were used for the detection of immunophenotype and blood cell counts of 3 CLL patients with different expression intensities of CD5, respectively. 1 patient with B-cell acute lymphocytic leukemia(B-ALL) was selected as negative control. ResultIn 4 patients with abnormal B lymphocytes, using fluorescein isothiocyanate(FITC) fluorescein-labeled antibody, no independent groups expressing CD5 were identified, and the proportions of CD5 positive cells were 47.1%, 17.7%, 6.7% and 7.9%. For ≥20% as standard, there was only 1 positive case. Re-tested with PE-Cy7 fluorescein-labeled antibody, however, there were independent groups of CD5 positive cells in case 1 and 2, and there was still a continuous expression pattern of CD5 in case 3. The proportions of CD5 positive cells increased to 91.1%, 70.3% and 38.2% in these 3 specimens from CLL patients. In case 4, the specimen from B-ALL patient, the proportions of CD5 positive cells were negative in the 2 conditions. Case 1, 2 and 3 were typical CLL phenotyping. ConclusionsCD5 is often abnormally expressed on B cells in CLL patients, but its expression intensity is significantly lower than that on T cells. Using weak fluorescein-labeled antibodies might miss CD5 expression on B cells, and thus it will affect the clinical diagnosis because of leak detection. It should select appropriate fluorescein-labeled antibodies for weakly expressed antigens and conduct validation and comparison to determine its accuracy, which is an important safeguard for the provision of correct disease phenotype.

基金項目：國家自然科學基金面上項目(81270638)；國家自然科學基金青年基金資助項目(81102249)

作者簡介：唐古生，男，1978年生，博士，主治醫(yī)師，主要研究方向為血液系統(tǒng)惡性疾病免疫學臨床診斷。

收稿日期：(2014-02-26)

Analysis on the missing detection of CD5 in chronic lymphocytic leukemia and its countermeasuresTANGGusheng,LIUMin,HUXiaoxia,GAOLei,YANGJianmin,WANGJianmin.(DepartmentofHematology,ChanghaiHospital,Shanghai200433,China)

Key words: CD5; Immunophenotype; Chronic lymphocytic leukemia; Flow cytometry; Leak detection

目前，最新的國內(nèi)外慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)/小淋巴細胞淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma, SLL)診斷標準中均納入了免疫表型的要求[1-3]。典型的CLL免疫表型為CD19+、CD5+、CD23+、CD43+/-、CD10-、 CD22dim、CD20dim、sIgdim和cyclin D1-。在CLL鑒別診斷中常采用CLL免疫表型積分，其中CD5+、CD23+、FMC-、sIgdim、CD22/CD79bdim/-各積1分。CLL患者通常積分為4~5分，積分低于4分者需要結(jié)合淋巴結(jié)、脾臟、骨髓組織學及遺傳學檢查等進行鑒別診斷。因此，細胞膜表面CD5標志的檢測對于CLL的診斷和鑒別診斷具有非常重要的意義。然而我們在常規(guī)CLL免疫表型檢測過程中發(fā)現(xiàn)，異常B細胞表面CD5表達明顯低于成熟T淋巴細胞表面CD5的表達。如果采用弱熒光素如異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標記進行檢測可能會導致白血病細胞表面CD5抗原表達率偏低，甚至漏檢。現(xiàn)從近期確診的CLL病例中選擇典型的3例患者，分析該問題在實際臨床工作中的表現(xiàn)及其解決策略。

材料和方法

一、對象

選擇2013年6至7月于上海市長海醫(yī)院血液科門診確診為CLL且CD5表達量呈低中高分布的典型患者3例(以Pa1~Pa3表示)，以急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)患者 1例(以Pa4表示)作為陰性對照。4例患者的臨床特征和實驗室檢查見表1。CLL診斷標準參照中國慢性淋巴細胞白血病診治指南(2011年版)[1]。B-ALL診斷標準參照中國成人急性淋巴細胞白血病診斷與治療專家共識(2012年)[4]。

表1　患者臨床資料特征

二、試劑和儀器

所用的單克隆抗體為美國Beckman-Coulter或BD公司產(chǎn)品，其中CD5檢測采用BD公司預(yù)混的三色組合：CD5-FITC、CD10-藻紅蛋白(phycoerythrin, PE)、CD19-Per-CP。本研究中重復檢測CD5時，采用CD5-PE-Cy7和CD19-APC單標抗體，CD5抗體為同一克隆號。流式細胞儀為美國BD公司FACSAria I型，熒光激發(fā)光波長488 nm和633 nm，系統(tǒng)分析軟件為DIVA 6.0.1。血常規(guī)檢測采用SYSMEX XE2100 全自動血液分析儀(Sysmex公司)。

三、檢測方法

采集所有患者外周血乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝標本2 mL，常規(guī)檢測血常規(guī)；骨髓穿刺獲取骨髓液標本3 mL，EDTA抗凝，涂片形態(tài)學證實無稀釋。 調(diào)整細胞數(shù)至每管白細胞總數(shù)為5×106，各指標根據(jù)抗體的顏色標記做適當組合。按說明書推薦用量加入抗體標本計數(shù)分管后先按各組合分別加入不同顏色標記的抗體，空白對照管加入采用各種顏色的同型對照。室溫避光孵育15 min，2 mL Tris-NH4Cl裂解液裂解紅細胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗滌后上機。檢測輕鏈的標本在加入抗體之前先用PBS洗滌3遍，以去除血漿中輕鏈對抗體的阻斷結(jié)合作用。檢測前常規(guī)進行儀器質(zhì)控監(jiān)測及熒光補償調(diào)節(jié)。檢測時首先根據(jù)前向散射光(forward scatter, FSC)和側(cè)向散射光(side scatter, SSC)信號、CD45和SSC對淋巴細胞進行設(shè)門，膜表面標志表達以≥20%判斷為陽性。

結(jié)果

4例患者的外周血和骨髓形態(tài)學檢測、初次檢測免疫表型表達結(jié)果見表1。4例患者CD5陽性細胞占CD19比例情況見圖1。

分析時以CD19陽性細胞設(shè)門選定B細胞[圖1(a)，P3門]，以未加抗體空白對照管，設(shè)定十字門初始位置，同時以CD19陰性和SSC低信號細胞群內(nèi)CD5陽性細胞(含T細胞)和CD5陰性細胞作為內(nèi)對照[見圖1(a)，P4門]，確定最終門的位置，計算CD5+CD19+/CD19+比例。圖中可見，4例患者CD19+B細胞均明顯成群，前3例(Pa1~Pa3)患者具有相似的SSC信號，Pa4 CD19+細胞SSC信號明顯增加[見圖1(a)，Pa4]。無論是FITC或PE-Cy7熒光素標記，4例患者T細胞CD5+細胞均獨立成群，而 B細胞異常表達CD5時，其熒光強度顯著低于自身T細胞表面CD5表達[見圖1(b)、(c)]。以FITC標記檢測CD5表達，前3例患者(Pa1~Pa3)B細胞表面CD5+細胞均未獨立成群，呈連續(xù)表達模式，CD5+細胞占CD19陽性細胞比例分別為47.1%、17.7%、6.7%，Pa4未見B細胞表面明顯CD5表達成群(見圖1(b)，Q2)。以膜表達≥20%為標準，僅Pa1 CD5表達陽性，Pa2、Pa3、Pa4 CD5表達均應(yīng)判為陰性。

注：以FSC、SSC和CD45、SSC設(shè)門圈定有核細胞后，以CD19+細胞設(shè)門[見(a)，P3門]，判斷CD5+細胞占CD19+細胞比例[見(b)、(c)]；以CD19-和SSC低信號細胞群內(nèi)CD5+細胞(含T細胞)和CD5-細胞作為內(nèi)對照[見圖1(a)，P4門]，設(shè)定十字Maker的位置，確定CD5+CD19+/CD19+細胞比例[Q2門內(nèi)數(shù)值(%)]；(b)列為FITC標記檢測CD5表達，(c)列為PE-Cy7標記檢測CD5表達

圖1FITC標記降低了檢測CLL患者B細胞表面CD5的檢出率

以高亮度的PE-Cy7標記的CD5抗體重新檢測這4例患者CD5表達。結(jié)果顯示Pa1和Pa2的CD19+CD5+細胞獨立成群，其占CD19+細胞比例分別顯著上升為91.1%、70.3%，見圖1中的Pa1和Pa2；而CD5表達仍呈連續(xù)表達模式，但CD5+細胞比例顯著上升，占38.2%，見圖1中的Pa3。此時，以膜表達≥20%為標準，3例患者CD5表達均可判為陽性。而Pa4采用PE-Cy7標記CD5檢測時， CD5+細胞比例與FITC標記時接近，少部分細胞表達強度高，疑似門內(nèi)混雜T細胞所致，且所占比例均未達到陽性標準，因此CD5表達判為陰性。

討論

近年來白血病的免疫分型已成為血液惡性腫瘤診斷不可缺少的重要依據(jù)之一，已經(jīng)被納入多種白血病的診斷標準，同時也是白血病治療后微小殘留灶檢測的重要方法之一。但在實際臨床使用中，涉及的流式細胞儀型號多樣、試劑種類繁多、選擇抗體組合的經(jīng)驗和習慣的也不同、各種指標采用的標記熒光素也大不相同，因此臨床檢測結(jié)果變異較大，準確性難以評價，實驗室間結(jié)果難以相互比對，結(jié)果分析需要較強的專業(yè)理論基礎(chǔ)和實踐經(jīng)驗。在選擇不同熒光素標記的指標時，其原則是需要同時考慮熒光強度和抗原表位密度，對表達少的抗原表位應(yīng)盡可能選擇強度強的熒光素。然而在實際使用過程中，并不是每個實驗室、針對每種疾病都能認識到這一點，并加以評估驗證和進行正確的臨床應(yīng)用。而且有些抗原表位在某些細胞上高表達，某些細胞上低表達，對這類抗原的檢測更需要對抗原本身的表達特點有深刻的了解，才能正確選擇標記熒光素的種類，做出正確的檢測結(jié)果。對于一些常見檢測指標如B細胞表面CD5/CD19/CD10等，試劑廠家通常會生產(chǎn)一些標記了各種熒光素的預(yù)混的抗體組合，以減少常規(guī)操作步驟，減少操作誤差。然而實際應(yīng)用中，這些預(yù)混的組合因為預(yù)先標記熒光素的限制，是否適合用于特定疾病指標的檢測仍需要進一步的臨床驗證。

對于CLL的免疫表型檢測，目前的診斷標準已經(jīng)提供了需要檢測的主要指標。但在實際的臨床工作中可能存在由于使用不恰當?shù)臒晒馑貥擞?，使得部分指標的檢出率偏低，某些重要指標甚至影響了疾病的診斷。在國內(nèi)對于CLL診斷的研究中，確診為CLL患者的CD5陰性率從2.9%~28.2%不等，跨度非常大，且絕大部分報道CLL患者的CD5陰性率超過10%[5-12]。而國外文獻報道CD5陰性B-CLL比例較低。大樣本前瞻性研究發(fā)現(xiàn)確診病例中僅約6.8%的患者為CD5-的非典型或變異型B-CLL[13-14]，國內(nèi)CD5-CLL的比率明顯高于國外。這與目前國內(nèi)外CLL的診斷標準把CD5+作為CLL的主要診斷依據(jù)似乎有一定的沖突。發(fā)生這種現(xiàn)象的原因可能與實驗室檢測手段和技術(shù)有一定的關(guān)系。因此本研究對確診的CLL患者的CD5采用不同熒光素標記抗體進行檢測，評價弱熒光素可能對CLL患者CD5檢測的影響。

本研究在既往臨床工作中針對臨床懷疑是CLL患者的標本，初次篩查CD5、CD10、CD19的試劑為預(yù)混的三色組合：CD5-FITC、CD10-PE、CD19-PerCP。發(fā)現(xiàn)盡管采用CD5-FITC可以正確檢測出部分CD5表達量較高的患者， CD5-FITC陽性B細胞在流式散點圖中也可以呈現(xiàn)獨立成群。但依然有部分患者盡管外周血B細胞絕對數(shù)、骨髓形態(tài)學和免疫表型特點均提示CLL診斷可能，但患者B淋巴細胞CD5未達到陽性判斷標準。進一步分析發(fā)現(xiàn)B細胞表面異常CD5的表達強度明顯低于患者體內(nèi)T細胞表面CD5表達，而該預(yù)混試劑組合中CD5采用熒光強度最弱的FITC進行標記?？紤]到弱熒光素標記弱表達抗原可能會造成該抗原檢測的假陰性結(jié)果，因此采用熒光強度較強的PE-Cy7標記CD5抗體，重新對這些患者進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分患者CD5陽性細胞比例均呈大幅度上調(diào)。本研究所列舉的3例患者中原來未能達到陽性標準的2例患者其CD5表達也判為陽性。綜合本實驗室外周血B細胞絕對數(shù)、骨髓形態(tài)學和臨床癥狀體征、其它免疫分子表達等各方面的證據(jù)，本研究中前3例患者均最終確診為CLL。從本研究所提供的流式圖形來看，病例2和3若按照CD5-FITC檢測結(jié)果判斷應(yīng)歸類于CD5-CLL，而按照CD5-PE-Cy7檢測結(jié)果判斷，這樣歸類顯然是不合適的，應(yīng)該屬于CD5+CLL患者。本研究所證實的這種人為檢測差異的存在可能是國內(nèi)文獻報道的CD5-CLL患者比例明顯高于國外的現(xiàn)象的重要原因。同時以明確為陰性表達的B-ALL患者標本(病例4)作為陰性對照，也證實本研究中第2次采用PE-Cy7標記重新檢測發(fā)現(xiàn)3例患者CD5表達顯著上調(diào)，并非是由于該熒光素提高了檢測背景，而是由于其本身熒光強度高，提高了弱表達抗原的檢測能力所致。所以，異常B細胞表面CD5的準確檢測對于CLL的診斷和鑒別診斷異常重要。CD5漏檢可人為增加CLL與其它CD5陰性或弱陽性慢性淋巴細胞增殖性疾病鑒別診斷的難度，甚至出現(xiàn)誤診，如脾邊緣區(qū)淋巴瘤、濾泡淋巴瘤以及毛細胞白血病等。

本研究結(jié)果顯示FITC標記的CD5抗體檢測T細胞表面CD5沒有問題。因為其CD5呈高表達，在流式散點圖上可見到陽性細胞獨立成群。然而B細胞表面表達CD5強度要弱很多，此時采用FITC標記就可能造成CD5表達檢出率偏低，導致臨床診斷困難。國內(nèi)多個實驗室曾采用FITC標記抗體檢測B細胞表面CD5[5-6]，存在CLL患者白血病細胞表面CD5漏檢的可能。因此建議各實驗室在使用該類試劑時，預(yù)先采用各種熒光素標記的CD5對確診為CLL的病例進行檢測，評價FITC標記的CD5在本實驗室的檢測系統(tǒng)中是否能夠正確提供CD5表達率的檢出情況，有條件時建議優(yōu)先選擇熒光強度較高的熒光素標記抗體檢測CD5表達。在臨床白血病和淋巴瘤其他免疫表型檢測中，對弱表達抗原選擇合適的熒光素標記，并在臨床實踐中加以驗證和比對，確定其檢測結(jié)果的準確性，對于提供疾病正確的免疫表型，進而為相關(guān)疾病的診斷提供充分的依據(jù)顯得異常重要，應(yīng)引起臨床醫(yī)生和實驗室流式檢測和報告人員的足夠重視。

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(本文編輯：范基農(nóng))