李慧敏　綜述，　傅啟華，　王　靜　審校

(上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心檢驗科，上海 200127)

膠體金在臨床檢驗診斷中的研究進展

李慧敏綜述，傅啟華，王靜審校

(上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心檢驗科，上海 200127)

摘要：膠體金是一種廣泛應用于納米診斷的納米材料，具有較大的比表面積，獨特的物理特征，良好的生物相容性和化學穩(wěn)定性。對膠體金進行特定的修飾可賦予其新的功能。本文主要對其在臨床檢驗診斷中的研究進展作一綜述。

關鍵詞：膠體金；實驗診斷；納米材料

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)01-0076-04R446.61

文獻標志碼：碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.01.019

Abstract:Gold nanoparticle is a type of nanomaterials, which is widely used in nanodiagnosis, and exhibits high surface-to-volume ratio, unique physical properties, excellent biocompatibility and chemical stability. Gold nanoparticle may easily be functionalized by modification with special molecules. In this review, we mainly focus on the recent advances of gold nanoparticle research in clinical laboratory diagnosis.

基金項目：上海交通大學“醫(yī)工交叉基金”重點項目(YG2012ZD03)

作者簡介：李慧敏，女，1988年生，碩士，主要從事分子診斷研究。

通訊作者：王靜，聯(lián)系電話：021-38625569。

收稿日期：(2014-02-20)

The research progress of gold nanoparticle in clinical laboratory diagnosisLIHuimin,FUQihua,WANGJing.(DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiChildren′sMedicalCenter,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,China)

Key words: Gold nanoparticle; Laboratory diagnosis; Nanomaterial

膠體金(gold nanoparticle)又稱為膠體納米金，具有較大的比表面積，獨特的光學、導電、導熱等物理特征以及良好的生物相容性。獨特的依賴其直徑大小的光學特征以及在生物流體中的惰性和穩(wěn)定性使膠體金逐漸成為納米診斷中最穩(wěn)定的材料[1]。通過選擇合適的合成方法即可調節(jié)由其大小和形狀決定的理化特性。通過在膠體金上連接巰基化DNA或蛋白質可賦予膠體金新的功能。膠體金所擁有的各種特性使其得以與不同的實驗方法相結合，進而廣泛應用于臨床檢驗診斷。本文對其在3個方面的研究進展作一綜述。

一、膠體金在免疫層析試紙條(immunochromatographic strip,ICS)法中的應用

膠體金在水溶液中溶解呈紅色膠體狀，在診斷實驗中膠體金聚集紅色更加明顯，且這種紅色肉眼即可鑒別。膠體金免疫標記技術正是基于膠體金的上述特性，將其作為示蹤標志物應用于抗原抗體檢測的一種新型免疫標記技術，是繼酶免疫標記、熒光免疫標記、同位素免疫標記三大標記技術之后迅速發(fā)展起來的新型免疫技術。其標記技術具有簡單、快速、準確和無污染等優(yōu)點，且檢測不依賴昂貴的激光檢測儀器，只需要普通光學儀器，甚至肉眼即可鑒別。膠體金ICS法生物傳感器正是運用了膠體金免疫標記技術而產(chǎn)生的[1-2]。膠體金與ICS的結合取得了很大的成就并且已成功應用于臨床檢測。通過與科研所需要的特定抗體或商業(yè)化途徑購買的試劑相結合，可以適應不同的實驗需求。一次性的測試條方便攜帶，所需費用低，能快速診斷來源于臨床、環(huán)境、食物等樣本中的生物分子，并取得可靠的檢測結果。

傳統(tǒng)的ICS包括樣本墊、金標墊、硝酸纖維素膜及吸收墊。金標墊上涂覆有抗體-膠體金結合物，可結合樣本中的靶抗原，組成抗原-抗體-膠體金復合物。這種復合物移動到硝酸纖維素膜上后被針對靶抗原的二抗捕獲，導致指示線出現(xiàn)紅色，而檢測區(qū)的另一條線上涂覆有抗IgG抗體，陰性和陽性的樣本在此處均出現(xiàn)紅色而作為對照線。近年來，該技術已進行了多種改進，如CHING等[3]對ICS設計了雙檢測線用于肉毒梭菌神經(jīng)毒素(botulinum neurotoxin, BoNT)的檢測。BoNT具有強大的神經(jīng)毒性，通過抑制乙酰膽堿的釋放導致中毒者癱瘓甚至死亡。其共有7個血清型，即BoNT/A~G，80%的中毒反應由包括BoNT/A和BoNT/B在內(nèi)的4個血清型所導致[4]。在檢測區(qū)分別涂覆抗BoNT/A單克隆抗體-膠體金復合物和抗BoNT/B單克隆抗體-膠體金復合物，可以分別并同時檢測最低5 ng/mL的BoNT/A和10 ng/mL的BoNT/B。改進后的方法操作簡便，敏感性高，不需要特定的儀器和實驗操作人員，且能同時分辨2種血清型的神經(jīng)毒素。

二、膠體金在比色法中的應用

一般情況下，膠體金(15 nm)溶解時成紅色膠體狀，在520 nm出現(xiàn)最大吸收波長，而聚集時呈現(xiàn)藍紫色，且最大吸收波長發(fā)生偏移。通過吸附核酸序列、抗體等分子，膠體金得以與比色分析法結合，為臨床診斷提供快速、簡便的檢測方法。膠體金擁有較大的比表面積，能夠提高蛋白質、核酸或其它生物分子的固載量，使電流信號響應增強，提高傳感器的敏感性。在過去的幾十年中，以膠體金為基礎的生物傳感器被成功地應用于核酸[5]、蛋白質[6]、凝血因子[7]和病毒核酸序列的檢測(如丙型肝炎病毒核酸序列的檢測[8])，且這些生物傳感器均具有較高的敏感性、特異性以及費用低等優(yōu)點。因此越來越多的科研人員開始關注于其作為生物傳感器在分子識別和核酸檢測方面的應用。單鏈DNA對帶負電荷的膠體金有很好的親和力，其與膠體金的結合可以抵抗鹽溶液對膠體金的聚集作用。膠體金對單鏈DNA的吸附作用取決于單鏈DNA的長度和反應溫度，較短的單鏈DNA和較高的反應溫度促進膠體金對單鏈DNA的吸附[9]。由于單鏈DNA具有易于折疊和解螺旋的特性，其暴露的堿基很容易通過范德華力吸附在膠體金上。其堿基上的氮原子可以將自身的負電荷傳遞給膠體金，增加膠體金所攜帶的負電荷和其之間的電荷排斥力，抑制其在鹽溶液中的聚集。DENG等[10]以炭疽桿菌核酸序列為模板，設計合適的引物，通過不對稱聚合酶鏈反應(asymmetric polymerase chain reaction, As-PCR)，擴增出不同長度的單鏈DNA(116nt、242nt、345nt、508nt)，將這些長度不同的單鏈DNA分別包被膠體金，結果表明這些單鏈DNA與膠體金結合后均能抵抗鹽溶液對膠體金的聚集作用，使膠體金呈現(xiàn)紅色。該文獻第1次報道了長片段DNA與膠體金的結合，且這些不同長度的PCR產(chǎn)物包括了我們?nèi)粘嶒炛谐Ｓ玫降钠伍L度，說明這種方法也同時可用于其他病原體的檢測。

越來越多的科研人員根據(jù)膠體金的上述特性發(fā)展了不同的檢測方法。GILL等[11]通過依賴解旋酶的恒溫擴增(thermophilic helicase-dependent isothermal amplification，tHDA)對幽門螺桿菌的ureC基因進行擴增，同時設計一對分別與擴增產(chǎn)物兩端互補的探針，將探針與膠體金結合并溶解在鹽溶液中，此時該溶液呈現(xiàn)紅色，且在520 nm處有最大吸收波長。將PCR擴增產(chǎn)物加入到上述溶液中，因探針與 PCR擴增所獲得的核酸序列兩端互補而結合在該序列兩端，克服膠體金之間的相互排斥作用，使膠體金發(fā)生聚集，膠體金溶液由紅色變?yōu)樗{紫色，且通過比色法分析發(fā)現(xiàn)最大吸收波長發(fā)生偏移。該方法具有一定的敏感性(可檢測最低10 CFU/mL的幽門螺桿菌)，適用于檢測核酸序列較長的基因。精液中果糖的含量反映精囊的功能，濃度過低可導致不育癥。RAJ等[12]將3-氨基苯硼酸和L-谷氨酸-三氯酯修飾在膠體金表面，待測樣本中的果糖可以與上述2種物質結合導致膠體金聚集，該方法操作簡便，檢測結果肉眼即可判斷，為臨床患者提供了極大的方便。透明質酸酶被看作是膀胱癌在尿液中的腫瘤標志物，NOSSIER等[13]將帶有多聚陰離子的透明質酸和經(jīng)處理后帶有正電荷的膠體金混合孵育，正負電荷之間的相互吸引導致膠體金的聚集，待檢樣本中含有的透明質酸酶可以把透明質酸降解為小的片段，阻止透明質酸對膠體金的吸附聚集作用。通過該方法可以定量檢測尿液中透明質酸酶的活性，為疑似膀胱癌患者提供有效的無創(chuàng)性檢測。

通過上述這些科研人員的嘗試，我們可以發(fā)現(xiàn)，膠體金應用于臨床檢測已不再局限于通過與核酸、蛋白的結合來實現(xiàn)，膠體金本身的特性決定了其廣泛的應用范圍?？梢愿鶕?jù)不同的檢測需求，靈活設計出不同的實驗方案。

三、膠體金在熒光共振能量轉移(fluorescent resonance energy transfer,FRET)及分子信標中的應用

FRET是基于熒光基團供體和熒光基團受體間偶極子-偶極子耦合作用的非輻射方式的能量傳遞現(xiàn)象。FRET生物傳感器廣泛應用于各種生物分子的檢測，如檢測蛋白酶活力[14]等。因AuNPs具有高效淬滅活性和穩(wěn)定的光學特性而被廣泛應用于FRET。具有生物相容性的膠體金可以通過一個通用平臺，為以超敏熒光為基礎的探針提供較高的淬滅活性且具有被靶分子特異性識別的特性[15]。具有代表性的是其在分子信標中的應用，見圖1。分子信標是一種在5′和3′末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結構的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，因此標記在一端的熒光基團與標記在另一端的AuNPs緊緊靠近，熒光基團(供體)受激發(fā)后產(chǎn)生的光子被AuNPs(受體)淬滅，因而不會產(chǎn)生熒光[16]。

注：A為用于檢測目的片段的分子信標，其中黑色的環(huán)狀單鏈DNA和目的片段互補,紅色單鏈DNA分別連接熒光集團和作為淬滅集團的AuNPs;B為目的片段;C為分子信標和目的片段結合，熒光集團和AuNPs分離，淬滅作用解除，發(fā)出熒光

圖1分子信標檢測目的核酸片段

近年來，隨著納米材料的廣泛使用，該技術也在原有的基礎上獲得了改進，使其更好地服務于臨床診斷和科學研究。如SONG等[17]將15 nm的膠體金作為受體，膠體金直徑的擴大使其表面可以同時交聯(lián)3種不同的特異寡核苷酸探針以識別特定核酸序列(定性)，且3種不同的特異寡核苷酸探針分別被3種不同顏色的熒光染料標記(定量)，這樣膠體金上的熒光光譜就能夠顯示樣本中目標序列的有無和多少，進而可以檢測到3種不同的生物分子，如腫瘤標志物。該方法的實現(xiàn)得益于膠體金較高的、基本上能淬滅所有熒光染料的淬滅活性，而不必去考慮優(yōu)化膠體金和不同的熒光染料配對時的條件。同時，由于探針的莖環(huán)結構存在構象限制，使該方法即使對單一錯配的序列也有著較高的序列特異性。

膠體金-蛋白質納米探針也被廣泛應用于FRET，膠體金和蛋白質之間的連接主要依靠暴露在蛋白質表面的-SH[18]和-NH2集團對膠體金的吸附、固定作用，以及蛋白質和膠體金之間的物理吸附作用[19]。通過膠體金和蛋白質的結合，DENG等[20]設計出一段可以被絲氨酸蛋白酶水解的肽鏈來連接分子信標中的供體和受體。絲氨酸蛋白酶是一種Ⅱ型跨膜蛋白，高表達于多種腫瘤細胞表面，對腫瘤細胞的早期增殖發(fā)揮調節(jié)作用。待測樣本中的絲氨酸蛋白酶通過水解肽鏈，使熒光基團與膠體金分離，淬滅作用被解除，熒光基團發(fā)出熒光。這些對分子信標技術的改善說明了膠體金和分子信標技術的結合在臨床檢驗診斷方面有著很大的發(fā)展空間。

四、展望

膠體金擁有廣泛的表面功能和生物結合能力以及獨特的物理特性，使其成功地應用于物理和化學多種領域。膠體金較高的比表面積，在多重檢測中所展現(xiàn)的高度敏感性和特異性，使其成為非常具有應用前景的納米材料?？烧{整的合成方法和幾乎沒有限制的理化功能基團，使其成為醫(yī)學診斷和治療中最熱門的納米材料[21]。膠體金ICS是一種成功的應用于臨床檢驗診斷的技術，特別適合于廣大基層醫(yī)院進行大批量、時間緊的檢測和大面積普查等。

然而，膠體金本身的性質包括其表面特性及直徑大小對實驗結果的影響，標記到膠體金表面的各種生物分子探針的穩(wěn)定性、活性、特異性以及某些實驗中需要用到的高分辨率檢測儀器卻在一定程度上限制了膠體金在臨床檢驗診斷中的推廣和應用。因此，需要更多研究人員的共同努力，在膠體金的表面修飾、生物分子標記及生化反應條件、相應的檢測儀器等方面進一步改進，使膠體金真正應用到臨床檢測。

參考文獻

[1]SYED MA, BOKHARI SH. Gold nanoparticle based microbial detection and identification[J]. J Biomed Nanotechnol, 2011, 7(2):229-237.

[2]HELFPENNY KC, WRIGHT DW. Nanoparticle detection of respiratory infection [J].Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol, 2010, 2(3):227-290.

[3]CHING KH, LIN A, MCGARVEY JA, et al. Rapid and selective detection of botulinum neurotoxin serotype-A and -B with a single immuno-chromatographic test strip[J]. J Immunol Methods, 2012, 380(1-2):23-29.

[4]SWAMINATHAN S. Molecular structures and functional relationships in clostridial neurotoxins[J]. FEBS J, 2011, 278(23):4467-4485.

[5]XIA F, ZUO X, YANG R, et al. Colorimetric detection of DNA, small molecules, proteins, and ions using unmodified gold nanoparticles and conjugated polyelectrolytes[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(24):10837-10841.

[6]FACCENDA A, BONHAM CA, VACRATSIS PO, et al. Gold nanoparticle enrichment method for identifying S-nitrosylation and S-glutathionylation sites in proteins[J]. J Am Chem Soc, 2010, 132(33):11392-11394.

[7]CHANDRAWATI R, STEVENS MM. Controlled assembly of peptide-functionalized gold nanoparticles for label-free detection of blood coagulation Factor ⅩⅢ activi-ty[J]. Chem Commun(Camb), 2014, 50(41):5431-5434.

[8]LIU S, WU P, LI W, et al. Ultrasensitive and selective electrochemical identification of hepatitis C virus genotype 1b based on specific endonuclease combined with gold nanoparticles signal amplification[J]. Anal Chem, 2011, 83(12):4752-4758.

[9]LI H, ROTHBERG LJ. Label-free colorimetric detection of specific sequences in genomic DNA amplified by the polymerase chain reaction[J]. J Am Chem Soc, 2004, 126(35):10958-10961.

[10]DENG H, ZHANG X, KUMAR A, et al. Long genomic DNA amplicons adsorption onto unmodified gold nanoparticles for colorimetric detection ofBacillusanthracis[J]. Chem Commun (Camb), 2013, 49(1):51-53.

[11]GILL P, ALVANDI AH, ABDUL-TEHRANI H. Colorimetric detection ofHelicobacterpyloriDNA using isothermal helicase-dependent amplification and gold nanoparticle probes[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2008, 62(2):119-124.

[12]RAJ V, VIJAYAN AN, JOSEPH K. Naked eye detection of infertility using fructose blue-a novel gold nanoparticle based fructose sensor[J]. Biosens Bioelectron, 2014, 54:171-174.

[13]NOSSIER AI, EISSA S, ISMAIL MF, et al. Direct detection of hyaluronidase in urine using cationic gold nanoparticles: a potential diagnostic test for bladder cancer[J]. Biosens Bioelectron, 2014, 54:7-14.

[14]HU HY, GEHRIG S, REITHER G, et al. FRET-based and other fluorescent proteinase probes[J]. Biotechnol J, 2014, 9(2):266-281.

[15]MU CJ, LAVAN DA, LANGER RS, et al. Self-assembled gold nanoparticle molecular probes for detecting proteolytic antivity in vivo[J].ACS Nano, 2010, 4(3):1511-1520.

[16]YUN CS, JAVIER A, JENNINGS T, et al. Nanometal surface energy transfer in optical rulers, breaking the FRET barrier[J]. J Am Chem Soc, 2005, 127(9):3115-3119.

[17]SONG S, LIANG Z, ZHANG J, et al. Gold-nanoparticle-based multicolor nanobeacons for sequence-specific DNA analysis[J]. Angew Chem Int Ed Engl, 2009, 48(46):8670-8674.

[18]WANG C, OUYANG J, WANG YY, et al. Sensitive assay of protease activity on a micro/nanofluidics preconcentrator fused with the fluorescence resonance energy transfer detection technique[J]. Anal Chem, 2014, 86(6):3216-3221.

[19]TSAI DH, DELRIO FW, KEENE AM, et al. Adsorption and conformation of serum albumin protein on gold nanoparticles investigated using dimensional measurements and in situ spectroscopic methods[J]. Langmuir, 2011, 27(6):2464-2477.

[20]DENG DW, ZHANG DY, LI Y, et al. Gold nan-oparticles based molecular beacons for in vitro and in vivo detection of matriptase expression on tumor[J]. Biosens Bioelectron ,2013, 49:216-221.

[21]SU S, ZUO X, PAN D, et al. Design and applications of gold nanoparticle conjugates by exploiting biomolecule-gold nanoparticle interactions[J]. Nanoscale, 2013, 5(7):2589-2599.

(本文編輯：姜敏)