吳立山，　陳淑芬，　胡治寶，　沈　敏，　周　俊

(寧波美康生物科技參考實驗室，浙江 寧波 315104)

IFCC參考方法對兩種常規(guī)檢測系統(tǒng)ALP結(jié)果正確度的驗證

吳立山，陳淑芬，胡治寶，沈敏，周俊

(寧波美康生物科技參考實驗室，浙江 寧波 315104)

摘要：目的評價常規(guī)檢測系統(tǒng)測定血清堿性磷酸酶(ALP)的正確度。方法以國際臨床化學(xué)聯(lián)合會(IFCC)參考方法和兩種常規(guī)檢測系統(tǒng)(簡稱A法、B法)同時測定20份新鮮單人份血清樣品。按美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)EP9-A2文件評價兩種常規(guī)檢測系統(tǒng)測定結(jié)果的正確度，并用改良Bland-Altman圖形分析法進行驗證，評價常規(guī)檢測系統(tǒng)與參考方法測定結(jié)果的一致性，綜合判斷常規(guī)檢測系統(tǒng)的測定結(jié)果。按CLSI EP14-A2文件評價A、B兩種方法校準品的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果A法、B法與IFCC參考方法測定結(jié)果的直線回歸方程分別為YA=0.982 9XIFCC+0.010 8，YB=0.938 3XIFCC+0.012 9，平均偏倚分別為-1.1%、-5.5%。A法和B法檢測結(jié)果的相關(guān)方程為YB=0.955 2XA+0.001 36，R2=0.997 6。A法和B法的校準品均存在基質(zhì)效應(yīng)，其中A法校準品的基質(zhì)效應(yīng)更明顯。結(jié)論A法與IFCC參考方法正確度性能一致，B法與IFCC參考方法正確度性能不一致。

關(guān)鍵詞：堿性磷酸酶；檢測系統(tǒng)；參考方法；基質(zhì)效應(yīng)

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)01-0044-05Q555

文獻標志碼：碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.01.011

Abstract:ObjectiveTo evaluate the accuracy of serum alkaline phosphatase (ALP) determination by routine measurement systems. MethodsThe fresh serum samples were determined simultaneously by the International Federation and Clinical Chemistry(IFCC) reference method and 2 routine measurement systems (A method and B method). The accuracies were evaluated according to the guideline of EP9-A2, the Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI). Meanwhile, the consistency of results between routine measurement systems and IFCC reference method was evaluated by improved Bland-Altman graphical analysis. The accuracies were evaluated comprehensively. The matrix effects of A and B methods were evaluated according to CLSI EP14-A2. ResultsThe regression equation of A method with IFCC reference method was YA= 0.982 9XIFCC+0.010 8, and the average bias was -1.1%. The regression equation of B method with IFCC reference method was YB=0.938 3XIFCC+ 0.012 9, and the average bias was -5.5%. The correlation equation between A method and B method was YB=0.955 2XA+0.001 36, R2=0.997 6. The calibrator matrix effects of both A method and B method were found, and the calibrator matrix effect of A method was more significant. ConclusionsThe accuracy of A method is consistent with that of IFCC reference method, and the accuracy of B method is inconsistent with that of IFCC reference method.

作者簡介：吳立山，男，1982年生，碩士，工程師，主要從事臨床生物化學(xué)量值溯源及質(zhì)量管理。

收稿日期：(2014-03-23)

Verification on the result accuracy of ALP by two routine measurement systems according to IFCC reference methodWULishan，CHENShufen，HUZhibao，SHENMin，ZHOUJun.(NingboMedicalSystemBiotechnologyReferenceLaboratory，ZhejiangNingbo315104，China)

Key words: Alkaline phosphatase；Measurement system；Reference method；Matrix effect

量值溯源是近年來臨床檢驗領(lǐng)域的研究熱點之一，是實現(xiàn)臨床檢驗結(jié)果標準化的唯一有效的途徑。而“方法學(xué)比較”法是一種評價臨床檢驗定量測量方法正確度的可靠方法[1]。目前，國內(nèi)實驗室有采用美國臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)EP9-A2文件所述的“方法學(xué)比較”法評價測量結(jié)果的正確度[2-3]，也有采用CLSI EP15-A2文件提出的“方法學(xué)比較”法，即采用新方法和被替代的方法同時檢測樣品來確認新方法的性能[4]。但有研究發(fā)現(xiàn)，不同的實驗方案、不同的數(shù)據(jù)處理方式在處理相同的測定數(shù)據(jù)時可得出不一致的結(jié)論[1]。采用“方法學(xué)比較”法進行正確度評價時，需用已知測量性能達到參考方法性能要求的參考方法測量程序作為“比較”方法。

陳寶榮等在采用“方法學(xué)比較”法評價常規(guī)檢測系統(tǒng)的正確度方面做了很多的研究工作。他們運用檢驗醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合委員會(Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM)公布的參考方法，依據(jù)CKSI EP9-A2文件評價了淀粉酶、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶、總膽紅素、葡萄糖等常規(guī)檢測系統(tǒng)的正確度[5-8]。在評價常規(guī)系統(tǒng)正確度時，需應(yīng)用穩(wěn)定的參考方法、嚴謹?shù)膶嶒灧桨?、正確的數(shù)據(jù)處理方案及評價標準等。我們采用(International Federation of Clinical Chemists，IFCC)參考方法和兩種常規(guī)檢測系統(tǒng)同時測定20份不同濃度的新鮮血清和校準品，按CLSI EP9-A2文件對常規(guī)檢測系統(tǒng)的正確度進行評價，按CLSI EP14-A2文件評價校準品的基質(zhì)效應(yīng)，以期實現(xiàn)常規(guī)檢測系統(tǒng)的溯源性，符合ISO 18153、ISO 15189文件對測量結(jié)果正確度的評價要求[9-10]。

材料和方法

一、材料

1.儀器(1)參考方法儀器：UV-2450 紫外可見分光光度計(日本SHIMADZU公司)、1523型點溫度計(美國FLUKE公司)、XS205DU型分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)、SevenMulti型pH計(瑞士METTLER TOLEDO公司)、移液器(德國Eppendorf AG公司)。所用儀器均通過相關(guān)部門鑒定或參考實驗室內(nèi)部文件校準；(2)常規(guī)檢測方法的儀器：HITACHI 7180全自動生化分析儀(日本日立公司)。

2.試劑(1)參考方法試劑：無水HEDTA(99%)、七水硫酸鋅(99%)、四水醋酸鎂(99%)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(95%)、六水磷酸對硝基苯二鈉鹽(99%)、氯化鈉(99.5%)，以上試劑均購自美國Sigma公司；(2)常規(guī)方法試劑：A公司(批號：20130116)、B公司(批號：20130301)生產(chǎn)的ALP試劑盒。

3.標準物質(zhì)、校準品、質(zhì)控品和血清樣品(1)標準物質(zhì)：有證參考物質(zhì)(JC-ERM Lot.006 ALP)，認定值為(154±5)U/L；(2)校準品：A、B兩家公司的校準品(批號分別為20130724、167254，認定值分別為5.568、4.3 μkat/L)；(3)質(zhì)控品：2012年IFCC組織的國際室間質(zhì)評樣品(RELA樣品，批號分別為RELA-A和RELA-B，參考值分別為10.010和6.289 μkat/L)，2012年衛(wèi)生部臨床檢驗中心樣品(批號分別為2012E07和2012E08，參考值分別為1.434和4.335 μkat/L)；(4)血清樣品：20種不同濃度新鮮單人份血清，ALP正常血清的參考區(qū)間為女性0.55～1.64 μkat/L，男性0.72～1.92 μkat/L。

二、標準物質(zhì)、校準品、質(zhì)控品和血清樣品的制備

臨用前30 min從冷凍柜取出標準物質(zhì)，室溫復(fù)溶，使用無CO2水、稱重法復(fù)溶，復(fù)溶后當天內(nèi)使用。以稱重法復(fù)溶校準品和質(zhì)控品，復(fù)溶后按說明書規(guī)定使用。取20份實驗當天不同濃度的新鮮患者血清制備血清樣品。

三、實驗方案

1.參考方法檢測方案按照IFCC參考方法準備實驗條件，用標準物質(zhì)JC-ERM Lot.006驗證參考方法測量結(jié)果的正確度，3次測量結(jié)果在“認定值±不確定度”范圍內(nèi)。用2012年RELA樣品驗證參考方法測量結(jié)果的精密度，要求樣品每天測定5次，連續(xù)測定2 d，10次測定結(jié)果變異系數(shù)(CV)≤1%。在參考方法測量的正確度和精密度達到要求后進行20份血清樣品測定。測定順序為質(zhì)控→樣品→質(zhì)控，每個樣品重復(fù)測定2次，每10份血清加測一個質(zhì)控。

2.常規(guī)方法檢測方案兩種檢測系統(tǒng)分別由A、B廠家試劑、各自的校準品以及試劑配套的參數(shù)、HITACHI 7180全自動生化分析儀組成(簡稱A法、B法)。兩種方法同時在同一儀器的不同通道上進行測定。按相關(guān)操作校準系統(tǒng)后，測定RELA樣品和20份新鮮血清樣品。每個樣品重復(fù)測定2次，取均值作為評價數(shù)據(jù)。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

采用Origin 8.0軟件進行統(tǒng)計分析。按CLSI EP9-A2文件評價兩種常規(guī)檢測系統(tǒng)測量結(jié)果的正確度，并用改良Bland-Altman圖形分析法進行驗證。根據(jù)CLSI EP14-A2文件[11]評價A、B兩種方法校準品的基質(zhì)效應(yīng)。

結(jié)果

一、測量數(shù)據(jù)的有效性檢驗

所有數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗無離群值。

二、IFCC參考方法的檢測性能

JC-ERM Lot.006的檢測結(jié)果在“認定值±不確定度”范圍內(nèi)。用2012年RELA樣品驗證參考方法的精密度，CV<1%，見表1。符合IFCC參考方法檢測的性能要求。

三、IFCC參考方法和A、B兩種常規(guī)方法檢測質(zhì)控(2012年RELA)樣品的結(jié)果

采用IFCC參考方法和A、B兩種常規(guī)方法測定質(zhì)控(2012年RELA)樣品，結(jié)果見表2。IFCC參考方法和B法2個樣品測定結(jié)果在要求范圍內(nèi)(等效限±5.25%)，A法2個樣品測定結(jié)果在要求范圍外，且均明顯偏高。

表1　本實驗室IFCC參考方法檢測性能

注：*表示2012年RELA參考結(jié)果[國際參考實驗室均值(剔除離群值)等效限±5.25%]

表2　質(zhì)控(2012年RELA)測定結(jié)果

注：*為國際參考實驗室均值(剔除離群值)等效限±5.25%；#為與參考值之間的偏倚程度

四、A法和B法測定結(jié)果的比較

采用A法和B法在HITACHI 7180全自動生化分析儀不同通道上同時測定20份不同濃度新鮮單人份血清樣品，以A法測定結(jié)果為X軸，B法測定結(jié)果為Y軸作圖。兩種檢測方法所得的檢測結(jié)果存在明顯的差異，A法結(jié)果明顯高于B法結(jié)果。見圖1。

注：Y=0.955 2X+0.001 36，R2=0.997 6

圖1A法與B法測定結(jié)果的比較

五、A法、B法與IFCC參考方法測定結(jié)果比較

采用A法和B法在HITACHI 7180全自動生化分析儀不同通道上同時測量20份不同濃度新鮮患者血清樣品。以IFCC參考方法作為比較方法，兩種檢測系統(tǒng)作為待評價方法，按CLSI EP9-A2文件和改良Bland-Altman圖形分析法進行評價。A法、B法與IFCC參考方法相比，A法測定結(jié)果略低，而B法測定結(jié)果則明顯偏低。見圖2、圖3。改良Bland-Altman圖形分析法顯示，與IFCC參考方法比較，A法所測值整體偏低1.1%，其平均偏倚在IFCC參考方法允許范圍內(nèi)，滿足可接受變異范圍的要求；而B法所測值整體偏低5.5%，已超出IFCC參考方法的允許范圍。見圖4、圖5。

注：Y= 0.982 9X+0.010 8，R2 = 0.999 8圖2　A法與IFCC參考方法測定結(jié)果比較

六、A法和B法校準品的基質(zhì)效應(yīng)評價

按CLSI EP14-A2文件評價A法和B法校準品的基質(zhì)效應(yīng)。采用IFCC參考方法和A、B法同時在HITACHI 7180全自動生化分析儀不同通道上檢測20份新鮮患者血清樣品和A、B兩法的校準品(以下分別稱為A校準品、B校準品)，以IFCC參考方法作為比較方法(X軸)，A、B法作為評價方法(Y軸)，用Origin 8軟件作圖評價A、B校準品的基質(zhì)效應(yīng)。A、B校準品均落在IFCC參考方法和兩種常規(guī)方法的直線回歸方程的±95%可信區(qū)間外，表明A、B校準品均存在基質(zhì)效應(yīng)，其中A校準品的基質(zhì)效應(yīng)更為明顯。見圖6、圖7。

注：Y= 0.938 3X+0.0129，R2= 0.996 3

圖3B法與IFCC參考方法測定結(jié)果比較

注：平均偏倚=-1.10%；絕對平均偏倚=1.26%

圖4A法與IFCC參考方法測定結(jié)果比較的

Bland-Altman圖

注：平均偏倚=-5.50%；絕對平均偏倚=5.50%

圖5B法與IFCC參考方法測定結(jié)果比較的

Bland-Altman圖

圖6　A校準品的基質(zhì)效應(yīng)

圖7　B校準品的基質(zhì)效應(yīng)

討論

CLSI EP9-A2文件的方法是目前臨床實驗室評價常規(guī)方法測量結(jié)果正確度的常用方法。它采用參考方法和常規(guī)方法同時測定不同濃度的血清樣品，比較兩種方法的一致性?！杜R床檢驗質(zhì)量管理技術(shù)基礎(chǔ)》[12]一書中指出：兩種方法的線性回歸方程斜率(a)在1.00 ± 0.02，截距(b)≈0作為一致性的標準。但截距≈0沒有一個具體的評價標準，且相關(guān)實驗數(shù)據(jù)表明，在斜率接近1時，有部分樣品存在嚴重的系統(tǒng)誤差。也就是說方法學(xué)比較可準確的反映參考方法與常規(guī)方法的相關(guān)性，但不能靈敏的反映常規(guī)方法的系統(tǒng)誤差。CLSI EP9-A2文件中的差異圖是“常規(guī)方法均值-參考方法均值”對“(常規(guī)方法均值+參考方法均值)/2”作圖。這種評價方法不能很直觀的反映常規(guī)方法與參考方法的偏倚程度。

本研究對傳統(tǒng)Bland-Altman圖形分析法進行改良，以參考方法測定結(jié)果為橫坐標，常規(guī)方法測定均值與參考方法測定結(jié)果的偏倚程度為縱坐標作圖(改良Bland-Altman圖形分析法)。這種驗證方法可以直觀的反應(yīng)常規(guī)方法與參考方法的偏倚程度。本研究以常規(guī)方法與參考方法的平均偏倚和絕對平均偏倚不超過±5.25%為標準(IFCC允許偏倚范圍)判斷常規(guī)方法的正確度。

本研究采用A法和B法在同一生化儀不同通道上同時測定20份不同濃度新鮮單人份血清樣品。結(jié)果顯示兩種檢測方法的檢測結(jié)果存在明顯差異，A法結(jié)果高于B法(見圖1)。

為驗證兩種常規(guī)方法測量結(jié)果的正確度，本研究按CLSI EP9-A2文件進行評價(見圖2、圖3)。A法與IFCC參考方法的線性回歸方程為Y=0.982 9X+0.010 8，R2=0.999 8；B法與IFCC參考方法的線性回歸方程為Y=0.938 3X+0.012 9，R2=0.996 3。由此可見A法、B法與IFCC參考方法測定結(jié)果均有良好的相關(guān)性，而且A法的線性在要求范圍內(nèi)(Y=aX+b，a=1.00±0.02，b≈0)，故判斷A法測定結(jié)果正確。同理得B法線性未在要求范圍內(nèi)，B法測定結(jié)果不正確。因方法學(xué)比較不能靈敏的反映常規(guī)方法的系統(tǒng)誤差，針對此缺陷需進一步證實。為進一步驗證上述結(jié)論，采用改良Bland-Altman圖形分析法進行進一步分析。

從圖4、圖5中可發(fā)現(xiàn)A法和B法測定結(jié)果散點基本上分布于水平零線以下，即測定結(jié)果與IFCC參考方法存在著一定程度的系統(tǒng)偏倚，其中A法的平均偏倚為-1.10%，其絕對平均偏倚為1.26%；B法的平均偏倚為-5.50%，其絕對平均偏倚為5.50%。因本研究以常規(guī)方法與參考方法的平均偏倚和絕對平均偏倚不超過±5.25%為標準來判斷常規(guī)方法的正確度。故認為A法的測定結(jié)果雖存在一定的系統(tǒng)偏倚，但結(jié)果在IFCC參考方法允許偏倚范圍內(nèi)，所有數(shù)據(jù)的變異亦能滿足臨床可接受變異范圍的要求，認為A法測定結(jié)果正確。而B法的測定結(jié)果存在較大的系統(tǒng)偏倚，且結(jié)果已超出IFCC參考方法的允許偏倚范圍，故認為B法測定結(jié)果不正確。

當參考物質(zhì)用于常規(guī)方法檢測時必須在所有方法間確認其互換性[13]。但是，校準品的功能畢竟不同于參考物質(zhì)。從圖6、圖7可以發(fā)現(xiàn)A法和B法配套的校準品在常規(guī)方法與參考方法間存在基質(zhì)效應(yīng)，A校準品更顯著，但實驗發(fā)現(xiàn)這并沒有影響測定結(jié)果的正確度。而B法基質(zhì)效應(yīng)雖然沒有如此明顯，但測定結(jié)果系統(tǒng)性偏低。

根據(jù)CLSI EP9-A2、EP14-A2文件和改良Bland-Altman圖形分析法進行綜合分析，可以判定A法測定結(jié)果正確；B法與IFCC參考方法測定結(jié)果正確度性能不一致，即B法測定結(jié)果不正確，引起不正確的原因是由于存在明顯的系統(tǒng)誤差。

由此可見，不同的檢測系統(tǒng)測定同一血清可得到不同的數(shù)據(jù)。因此，各廠家急需建立檢測項目常規(guī)測量系統(tǒng)的測量正確度的評價方法，從而實現(xiàn)常規(guī)檢測系統(tǒng)的溯源性。由于條件限制，本研究的數(shù)據(jù)僅僅是一個單位的實驗結(jié)果，如果能經(jīng)過多個單位實驗得到相似結(jié)果，則結(jié)論可能更有說服力。

參考文獻

[1]陳寶榮. “方法學(xué)比較”法評價臨床檢驗定量測量方法正確度時應(yīng)注意的問題與對策[J]. 臨床檢驗雜志，2012，30(10): 821-825.

[2]Clinical and Laboratory Standards Institute. Method comparison and bias estimation using patient samples; approved guideline[S]. EP9-A2, CLSI， 2002.

[3]International vocabulary of metrology-basic and general concepts and associated terms [S]. JCGM 2000，2008.

[4]Clinical and Laboratory Standards Institute. User verification of performance for precision and trueness; approved guideline-second edition [S]. EP15-A2, CLSI, 2006.

[5]陳寶榮，孫慧穎，邵燕，等. 四種血清α-淀粉酶廠家系統(tǒng)測量結(jié)果的正確性評價[J]. 中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2012，35(4): 309-316.

[6]邵燕，孫慧穎，胡濱，等. 血清總膽紅素常規(guī)系統(tǒng)測量結(jié)果的正確度評價[J]. 標記免疫分析與臨床，2013，20(4): 266-268.

[7]陳寶榮，孫慧穎，邵燕，等. IFCC參考方法對兩種測量系統(tǒng)GGT結(jié)果正確性的驗證[J]. 標記免疫分析與臨床，2011，18(5): 336-341.

[8]孫慧穎，邵燕，胡濱，等. 7種血清葡萄糖常規(guī)檢測系統(tǒng)測量結(jié)果的正確度評價[J]. 臨床檢驗雜志，2013，31(7): 542-544.

[9]In vitro diagnostic medical devices measurement of quantities in biological samples metrological traceability of values for catalytic concentration of enzymes assigned to calibrators and control materials [S]. ISO 18153，2003.

[10]Medical laboratories-particular requirements for quality and competence [S]. ISO 15189，2003.

[11]Clinical and Laboratory Standards Institute. Evaluation of matrix effects; approved guideline [S]. EP14-A2, CLSI, 2002.

[12]馮仁豐. 臨床檢驗質(zhì)量管理技術(shù)基礎(chǔ)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)文獻出版社, 2003：7.

[13]馮仁豐. 互換性依然是問題[J].檢驗醫(yī)學(xué)，2013，28(12):1063-1068.

(本文編輯：龔曉霖)