朱蕾蕾，李　辰，張逸凡，鐘大放，李　珍*，蔣　健*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院臨床藥理科，上海 201203；2.上海藥物代謝研究中心，上海 201203)

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鹽酸美金剛片的人體生物等效性研究

朱蕾蕾1，李辰2，張逸凡2，鐘大放2，李珍1*，蔣健1*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院臨床藥理科，上海 201203；2.上海藥物代謝研究中心，上海 201203)

[摘要]目的：評(píng)價(jià)鹽酸美金剛片受試制劑和參比制劑在體內(nèi)的生物等效性。方法：24例男性健康志愿者隨機(jī)分為兩組，采用隨機(jī)、開放、雙周期、兩制劑交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別空腹單次口服鹽酸美金剛片10 mg的受試制劑或參比制劑，經(jīng)28 d洗脫期后，兩組志愿者交叉服藥。收集給藥前和給藥后不同時(shí)間的血液，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測(cè)定血漿美金剛濃度，采用非房室模型法計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)tmax、cmax、AUC0～t、AUC0～∞、MRT和t1/2。結(jié)果：鹽酸美金剛片受試制劑和參比制劑的tmax分別為(8.29±4.7)和(9.04±4.2) h；cmax分別為(13.3±1.82)和(12.1±1.66) ng/ml；AUC0～∞分別為(1140±200)和(1080±224) ng·h·ml-1；t1/2分別為(60.2±11.4)和(59.1±12.6) h。受試制劑的相對(duì)生物利用度為(107.1±12.6)%。受試制劑與參比制劑AUC0～t和cmax幾何均值比的90%可信區(qū)間均落在80%～125%。結(jié)論：鹽酸美金剛片受試制劑和參比制劑具有生物等效性。

[關(guān)鍵詞]鹽酸美金剛；生物等效性；色譜法，高效液相；串聯(lián)質(zhì)譜法

[Pharm Care Res，2015，15(6): 432-435]

E-mail：zhuleilei1981@163.com

鹽酸美金剛(memantine hydrochloride)是第一個(gè)用于治療中、重度阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)拮抗劑，可抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的過度釋放、減輕因谷氨酸過度釋放、鈣離子過多所致的神經(jīng)元細(xì)胞中毒、損傷和死亡，從而改善癡呆病人的癥狀和功能。本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測(cè)定鹽酸美金剛片的血藥濃度，計(jì)算相應(yīng)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，比較受試制劑與參比制劑的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，進(jìn)行生物等效性評(píng)價(jià)，為藥品注冊(cè)和臨床合理用藥提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1受試對(duì)象24例健康男性受試者，年齡(24.50±2.87)歲(20～28歲)，身高(173.29±3.69) cm，體重(66.83±5.05) kg(60～77 kg)，體重指數(shù)(22.24±1.22) kg/m2(20.24～23.89 kg/m2)。試驗(yàn)前經(jīng)體格檢查，血、尿常規(guī)，肝、腎功能，乙肝表面抗原、丙肝抗體、HIV抗體、心電圖等檢查均無異常，無各系統(tǒng)疾病病史，無藥物過敏史，無煙酒嗜好。試驗(yàn)前3個(gè)月內(nèi)未參加過其他臨床試驗(yàn)，試驗(yàn)前2周內(nèi)未服用過任何中西藥物。試驗(yàn)方案經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施，所有受試者試驗(yàn)前均簽署知情同意書。

1.2藥品、試劑和儀器受試制劑(T)：鹽酸美金剛片(10 mg/片，批號(hào)20130901，山西振東安特生物制藥有限公司)；參比制劑(R)：鹽酸美金剛片(10 mg/片，批號(hào)260916，丹麥靈北藥廠)。鹽酸美金剛對(duì)照品(批號(hào)20130601，純度99.6%，山西振東安特生物制藥有限公司)；內(nèi)標(biāo)鹽酸美金剛-d6(批號(hào)1-PSB-167-1，化學(xué)純度98%，同位素純度98%，加拿大Toronto Research Chemicals Inc.)。乙腈、甲醇(德國(guó)Merck公司)，醋酸銨(美國(guó)ROE公司)，甲酸(德國(guó)Fluka公司)均為色譜純。水為法國(guó)Millipore超純水儀制備的去離子水。

1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)和血樣采集試驗(yàn)采用單中心、隨機(jī)、開放、雙周期、兩制劑交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，兩個(gè)周期之間的清洗期為28 d。24例男性健康受試者隨機(jī)分為兩組，每組12人，一組先服用受試制劑，后服用參比制劑；另一組先服用參比制劑，后服用受試制劑。受試者于試驗(yàn)當(dāng)天早上7:30(禁食10 h以上)單次口服鹽酸美金剛片受試制劑或參比制劑10 mg，用200 ml溫開水送服。給藥2 h后方可飲水，給藥后4 h和10 h統(tǒng)一進(jìn)清淡飲食。給藥后避免劇烈活動(dòng)，亦不得長(zhǎng)時(shí)間臥床，試驗(yàn)期間禁用茶、咖啡及其他含咖啡因或醇類飲料，禁止吸煙和飲酒。于給藥前(0 h)及給藥后1、2、3、4、5、6、8、10、12、24、48、72、120、168、216、288和360 h于肘靜脈采血4 ml，置EDTA-K2試管中，2360×g離心10 min，分離血漿，于-20 ℃冰箱中冷凍保存。

1.4血藥濃度測(cè)定方法

1.4.1儀器Agilent 1200液相色譜系統(tǒng)，包括G1312B型二元輸液泵，G1367C型自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A型柱溫箱和G1322A型脫氣機(jī)(美國(guó)Agilent公司)；TSQ Quantum Ultra型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀[配備加熱電噴霧電離源(ESI源)和數(shù)據(jù)采集Xcalibur 2.0.7軟件，美國(guó)ThermoFinnigan公司]；Hitachi CT15RE型臺(tái)式高速離心機(jī)(日本日立公司)。

1.4.2色譜條件和質(zhì)譜條件分析柱：SB-C8柱(150 mm×4.6 mm，5.0 μm，美國(guó)Agilent公司)；預(yù)柱：C18保護(hù)柱(4.0 mm×3.0 mm，5.0 μm，美國(guó)Phenomenex公司)；流動(dòng)相：(甲醇∶5 mmol/L醋酸銨水溶液∶甲酸的體積分?jǐn)?shù)為80∶20∶0.1)；流速：0.6 ml/min；進(jìn)樣量：10.0 μl；柱溫：室溫。離子源為加熱電噴霧電離源(HESI)，正離子方式檢測(cè)；氣化室溫度為200 ℃；加熱毛細(xì)管溫度為320 ℃；輔助氣(N2)壓力為103.35 kPa (15 Arb,1 Arb=6.89 kPa)；鞘氣(N2)壓力為275.6 kPa (40 Arb)；吹掃氣(N2)壓力為13.78 kPa(2.0 Arb)。掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)，碰撞氣壓力為0.20 Pa (1.5 mTorr,1 Torr=133.322 Pa)；碰撞能量(CE)均為15 eV。用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z180.2→163.2(美金剛)，m/z186.2→169.2(內(nèi)標(biāo)美金剛-d6)；掃描時(shí)間為500 ms。

1.4.3血漿樣品處理向200 μl血漿樣品中分別加入內(nèi)標(biāo)溶液(5.00 ng/ml的美金剛-d6)50.0 μl，甲醇-水溶液(體積分?jǐn)?shù)為50∶50)50.0 μl，0.05 mol/L NaOH溶液100 μl后，渦流1 min，加入乙酸乙酯2 ml，渦流混合1 min后，2360×g離心5 min，取全部上層有機(jī)層于40 ℃空氣流吹干后，加入100 μl流動(dòng)相(甲醇∶5 mmol/L醋酸銨水溶液∶甲酸的體積分?jǐn)?shù)為80∶20∶0.1)，渦流混勻，取上清液10.0 μl進(jìn)行LC-MS/MS分析。

1.4.4方法特異性考察在此色譜條件下，用6名受試者的空白血漿及相應(yīng)空白血漿配制的定量下限(LLOQ)樣品，評(píng)價(jià)方法的專屬性。結(jié)果表明，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，典型色譜圖見圖1，表明該方法專屬性較好。

圖1　美金剛的色譜圖Figure 1　Chromatograms of memantineA:空白血漿；B:對(duì)照品+空白血漿；C:受試者給藥后血漿；A1、B1、C1：美金剛；A2、B2、C2：內(nèi)標(biāo)美金剛-d6

1.4.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備和最低檢測(cè)濃度確定取受試者空白血漿，配制成相當(dāng)于美金剛血漿濃度分別為0.100、0.200、0.500、1.00、2.00、5.00、10.0和25.0 ng/ml的血漿樣品，以待測(cè)物濃度(X)為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線回歸方程為：Y=1.11X+2.91×10-3，線性范圍為0.100～25.0 ng/ml，最低檢測(cè)濃度為0.100 ng/ml。

1.4.6精密度和回收率實(shí)驗(yàn)配制0.300、3.00、20.0 ng/ml的美金剛血漿樣品，按照1.4.3項(xiàng)下方法處理，取上清液10.0 μl進(jìn)行LC-MS/MS分析。3個(gè)不同濃度的待測(cè)物，每個(gè)濃度進(jìn)行6樣本分析，分別在3 d內(nèi)測(cè)試，計(jì)算日內(nèi)精密度和日間精密度。從表1可見，3個(gè)濃度美金剛的日內(nèi)RSD均<4.9%，日間RSD均≤6.0%，日內(nèi)RE為1.4%～6.9%。將上述3種濃度的血漿樣品及空白血漿樣品均按照1.4.3項(xiàng)方法處理，空白血漿樣品經(jīng)處理后加入相應(yīng)藥物，使之濃度為0.300、3.00 和20.0 ng/ml，以提取后峰面積與未經(jīng)提取獲得的峰面積之比計(jì)算回收率，每一待測(cè)物及相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的回收率均>70%，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)<6.4%。結(jié)果見表1。

1.4.7基質(zhì)效應(yīng)考察取6個(gè)不同來源的人空白血漿和1份溶血血漿，加入0.05 mol/L NaOH溶液100 μl和乙酸乙酯2.00 ml進(jìn)行相同處理，向獲得的全部上清液中分別加入1.20、80.0 ng/ml的質(zhì)控工作溶液50 μl和內(nèi)標(biāo)溶液50 μl，渦旋混合，2360×g離心5 min。取全部上層有機(jī)層于40 ℃空氣流吹干后，加入100 μl流動(dòng)相，渦旋混勻，取上清液10 μl進(jìn)行LC-MS/MS分析； 同時(shí)用水代替空白血漿，同法操作后進(jìn)行LC-MS/MS分析。以每一濃度兩種處理方法的待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。1.20、80.0 ng/ml美金剛?cè)搜獫{樣品經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正的基質(zhì)效應(yīng)分別為96.2%和96.3%，RSD分別為3.7%和1.7%。結(jié)果表明，在此色譜條件下可忽略基質(zhì)效應(yīng)的影響。

表1精密度及回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Table 1Results of precision and recovery tests

加入血漿濃度(ρB/ng·ml-1)測(cè)定結(jié)果(ρB/ng·ml-1)日內(nèi)RSD(%)日間RSD(%)日內(nèi)RE(%)內(nèi)標(biāo)校正后的提取回收率(%)0.1000.0974±0.014314.712.0-2.60.3000.308±0.01504.96.02.880.43.003.21±0.03841.23.56.970.920.020.38±0.6403.12.51.482.7

1.4.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)分別考察美金剛0.300、20.0 ng/ml的血漿樣品室溫放置6 h、全血樣品室溫放置1 h、血漿樣品經(jīng)液-液萃取處理后室溫放置24 h、血漿樣品經(jīng)3次凍-融循環(huán)、血漿樣品-20 ℃放置82 d的穩(wěn)定性。結(jié)果美金剛血漿樣品室溫放置6 h穩(wěn)定，RE為-0.4 %～3.4%；全血樣品室溫放置1 h穩(wěn)定，RE為-9.2%～-2.5%；經(jīng)歷3次凍-融循環(huán)穩(wěn)定，RE為1.0%～2.4%；血漿樣品提取后室溫放置24 h穩(wěn)定，RE為-5.9%～-0.6%；血漿樣品于-20 ℃放置82 d穩(wěn)定，RE為5.1%～5.6%。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用Phoenix WinNonlin 6.3藥動(dòng)學(xué)分析軟件(Pharsight 公司)，采用非房室模型法(NCA)計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)tmax、cmax、AUC0～t、AUC0～∞、MRT和t1/2。AUC計(jì)算采用Linear Trapezoidal with Linear Interpolation 梯形法，tmax、cmax為實(shí)測(cè)值。對(duì)主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(AUC，cmax)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析和雙單側(cè)t檢驗(yàn)，采用 90%CI 法進(jìn)行兩制劑的生物等效性評(píng)價(jià)，tmax采用Wilcoxon檢驗(yàn)，如美金剛的受試制劑與參比制劑AUC0～t和cmax幾何均值比的90%CI在80%～125%，則可認(rèn)為受試制劑與參比制劑具有生物等效性。對(duì)受試者人口學(xué)指標(biāo)和安全性數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果

2.1血藥濃度-時(shí)間曲線24名男性健康受試者空腹單次口服10 mg鹽酸美金剛片受試制劑和參比制劑后，平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。

圖2　健康志愿者單次口服10 mg鹽酸美金剛片受試制劑和參比制劑后的血藥濃度-時(shí)間曲線Figure 2　Plasma concentration-time curves of memantine after a single oral dose of 10 mg memantine hydrochloride test and reference preparations in healthy volunteers○：參比制劑；●：受試制劑；n=24，±s

2.2主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)24 名男性健康志愿者空腹單次口服10 mg鹽酸美金剛片受試制劑和參比制劑后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表2。

2.3生物等效性評(píng)價(jià)方差分析結(jié)果顯示，兩種鹽酸美金剛片的AUC0～t、AUC0～∞、cmax在給藥順序、制劑和周期間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。雙單側(cè)t檢驗(yàn)顯示兩制劑具有生物等效性，受試制劑與參比制劑AUC0～∞、AUC0～t和cmax幾何均值比的90%CI分別為102.76%～110.83%、102.31%～110.74%、106.92%～113.05%。受試制劑的tmax與參比制劑比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4臨床觀察在整個(gè)試驗(yàn)過程中，有專職醫(yī)護(hù)人員對(duì)受試者進(jìn)行相關(guān)的醫(yī)學(xué)監(jiān)護(hù)。共發(fā)生1 例2 次不良事件，試驗(yàn)第Ⅰ周期出現(xiàn)咽痛，試驗(yàn)結(jié)束后體檢間接膽紅素輕度升高，均未予特殊處理，短時(shí)內(nèi)自行恢復(fù)，結(jié)合受試者有受涼史及試驗(yàn)藥物已知的不良反應(yīng)，經(jīng)臨床醫(yī)師判斷均與試驗(yàn)藥物無關(guān)。

表2健康志愿者單次口服10 mg鹽酸美金剛片受試制劑和參比制劑后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

Table 2Main pharmacokinetic parameters of memantine after a single oral dose of 10 mg

memantine hydrochloride test and reference preparations in healthy volunteers

組別cmax(ρB/ng·ml-1)tmax(t/h)t1/2(t/h)AUC0～t(A/ng·h·ml-1)AUC0～∞(A/ng·h·ml-1)F(%)受試制劑13.3±1.828.29±4.760.2±11.41110±1861140±200107.1±12.6參比制劑12.1±1.669.04±4.259.1±12.61050±2091080±224100

3討論

文獻(xiàn)報(bào)道用HPLC和GC-MS法測(cè)定美金剛的血藥濃度，但是這些方法靈敏度低或過程復(fù)雜，不適用于大樣本的研究。本研究采用LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中美金剛濃度，所建方法準(zhǔn)確、可靠、簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高，相比其他的檢測(cè)方法有顯著的優(yōu)勢(shì)[1]，測(cè)得的兩種制劑的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[2，3]。等效性分析結(jié)果表明，鹽酸美金剛片受試制劑與參比制劑的AUC和cmax幾何均值比的90%CI均落在80%～125%，表明受試制劑和參比制劑在體內(nèi)的吸收、分布、消除過程相似，兩種制劑具有生物等效性。

【參考文獻(xiàn)】

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[2]鄭恒，周華，任麗，等. 鹽酸美金剛片在中國(guó)健康人體的生物等效性[J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32(24)：1964-1967.

Zheng Heng，Zhou Hua，Ren Li，etal. Study on the bioequivalence of memantine hydrochloride tablets in Chinese healthy volunteers[J]. Chin Hosp Pharm J,2012，32(24)：1964-1967. In Chinese with English abstract.

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Zhang XueMing. Pharmacokinetic study of memantine hydrochloride tablets in healthy volunteers[J]. China Pharmacy，2014，25(10)：893-895. In Chinese with English abstract.

[修回日期]2015-08-13

[本文編輯]貢沁燕

·論著·

Bioequivalence of memantine hydrochloride tablets in healthy volunteers

ZHU LeiLei1, LI Chen2, ZHANG YiFan2, ZHONG DaFang2, LI Zhen1*, JIANG Jian1*(1. Department of Clinical Pharmacology, Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203，China；2.Shanghai Center for Drug Metabolism and Pharmacokinetics Research, Shanghai 201203，China)

[ABSTRACT]Objective: To evaluate the bioequivalence of memantine hydrochloride test and reference preparations in healthy volunteers. Methods: Twenty-four healthy male volunteers were randomly administered with an oral single dose of 10 mg test or reference memantine hydrochloride tablets in an open-label, 2-period crossover study with a 28 d washout period. The blood samples were collected at the scheduled time before and after administration. The plasma concentrations of memantine were determined by LC-MS/MS method. The pharmacokinetic parameters tmax,cmax,AUC0-t,AUC0-∞,MRT and t1/2were calculated by non compartmental model method.Results:The main pharmacokinetic parameters of the test and reference memantine hydrochloride preparations were as follows: tmax(8.29±4.7) and (9.04±4.2) h;cmax(13.3±1.82) and (12.1±1.66) ng/ml;AUC0-∞(1140±200) and (1080±224) ng·h·ml-1;t1/2(60.2±11.4) and (59.1±12.6) h,respectively. The relative bioavailability of the test preparations was (107.1±12.6)%.Ninety percent confidence intervals (CI) of both the geometric mean value ratios of AUC0-tand cmaxwere 80%-125%.Conclusion:Memantine hydrochloride test and reference preparations have bioequivalence.

[KEY WORDS]memantine hydrochloride;bioequivalence;chromatography,high performance liquid;tandem mass spectrometry

[收稿日期]2015-02-04

通信作者*(Corresponding author)：李珍，E-mail：lizhen-01@163.com；蔣健，E-mail：jiangjiansg@126.com

作者簡(jiǎn)介朱蕾蕾(女)，主治醫(yī)師.

基金項(xiàng)目國(guó)家科技重大專項(xiàng)子課題(2012ZX09303009-001);上海市進(jìn)一步加快中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動(dòng)計(jì)劃(2014年-2016年) 中醫(yī)藥專門人才計(jì)劃(ZY3-RCPY-3-1059)

DOI：10.5428/pcar20150611

[中圖分類號(hào)]R969.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-2838(2015)06-0432-04