王　慧，李　洋，周燕妮，費(fèi)　揚(yáng)，萬賀臨，張國慶(第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院藥材科，上海 200438)

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用HPLC法同時測定扶正平消膠囊中龍膽苦苷和迷迭香酸的含量

王慧，李洋，周燕妮，費(fèi)揚(yáng)，萬賀臨，張國慶*(第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院藥材科，上海 200438)

[摘要]目的：建立HPLC法同時測定扶正平消膠囊中龍膽苦苷和迷迭香酸的含量。方法：采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，以0.1%甲酸(A)-乙腈(B)為流動相進(jìn)行梯度洗脫，0～5 min 88% A,5～10 min 88%～82% A,10～15 min 82%～70% A,15～20 min 70%～60% A；流速1.0 ml/min；柱溫25 ℃；檢測波長280 nm。結(jié)果：龍膽苦苷在6.75～431.6 μg/ml(r=1.000)，迷迭香酸在3.16～201.8 μg/ml范圍內(nèi)呈良好線性(r=1.000)。日內(nèi)和日間精密度均<2%(n=3)。平均加樣回收率分別為(100.89±2.25)%和(98.19±1.13)% (n=6)。結(jié)論：該方法簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于扶正平消膠囊中龍膽苦苷和迷迭香酸的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞]龍膽苦苷；迷迭香酸；含量測定；扶正平消膠囊；色譜法，高效液相

[Pharm Care Res，2015，15(6): 436-438]

E-mail:wang_ehbh@126.com

扶正平消膠囊是針對腫瘤病人氣滯血瘀、熱毒內(nèi)蘊(yùn)、肝失疏泄、氣陰兩虛的病機(jī)理論，采用行氣破血、扶正抗邪的抗癌中藥對癥治療，并且結(jié)合臨床長期研究，篩選精煉組方而制成的醫(yī)院制劑。該制劑由黃芪、玄參、夏枯草、吳茱萸、龍膽等28味中藥組成，其中龍膽和夏枯草為君藥。龍膽為龍膽科植物條葉龍膽、龍膽、三花龍膽或滇龍膽的干燥根和根莖，具有清熱燥濕、瀉肝膽火功效，用于治療濕熱黃疸、陰腫陰癢、帶下、濕疹瘙癢、肝火目赤、耳聾耳鳴、脅痛口苦、強(qiáng)中、驚風(fēng)抽搐等癥狀[1]。藥理研究證明，龍膽中的主要活性成分龍膽苦苷具有抗炎鎮(zhèn)痛、保肝利膽、健胃、抗腫瘤、抗氧化、清除自由基、促進(jìn)傷口愈合等作用[2]，對四氯化碳所致肝損傷整體動物有保護(hù)作用[3]，對SMMC-7721人肝癌細(xì)胞具有殺傷效應(yīng)，可抑制人肝癌細(xì)胞的增殖。夏枯草為唇形科植物夏枯草的干燥果穗，具有清肝瀉火、明目、散結(jié)消腫的功效，用于治療目赤腫痛、目珠夜痛、頭痛眩暈、瘰疬、癭瘤、乳癰、乳癖、乳房脹痛[1]。夏枯草中的主要活性成分迷迭香酸具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗輻射與抗誘變活性、抗血栓和抗血小板凝聚以及對細(xì)胞的保護(hù)作用[4]。迷迭香酸等3種多酚類化合物對137Cs γ射線致人外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變有防護(hù)作用，且迷迭香酸能夠顯著降低1，2-二甲基肼誘導(dǎo)的家兔結(jié)腸癌的發(fā)生率[4]。根據(jù)《軍隊醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑工作手冊》規(guī)定，必須對中藥制劑中的君藥成分進(jìn)行含量測定，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[5,6]，作者采用高效液相色譜-紫外檢測法對扶正平消膠囊中的龍膽苦苷和迷迭香酸進(jìn)行含量測定，為該制劑建立操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好、成本更低的質(zhì)量控制方法。

1儀器和試藥

1.1儀器Agilent 1100系列高效液相色譜儀，包括真空脫氣機(jī)、四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱和VWD檢測器(美國安捷倫公司)； METTLER AE240型十萬分之一電子天平(德國梅特勒公司)；SB3200-T超聲波清洗器(上海必能信超聲有限公司)；PW UItra-pure超純水系統(tǒng)(香港Heal Force公司)。

1.2試藥扶正平消膠囊(批號20140101)由第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院制劑室提供，0.25 g/粒；龍膽苦苷及迷迭香酸對照品購自詩丹德公司(純度>98%)；乙腈、甲醇為色譜純(美國Honeywell 公司)；甲酸為色譜純(美國Sigma公司)，水為超純水。

2方法和結(jié)果

2.1色譜條件Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以0.1%甲酸(A)和乙腈(B)為流動相，梯度洗脫(V∶V)：0～5 min 88% A，5～10 min 88%～82% A， 10～15 min 82%～70% A，15～20 min 70%～60% A；柱后平衡時間4 min；流速為1.0 ml/min；柱溫25 ℃；紫外檢測波長280 nm；進(jìn)樣量5 μl。

2.2溶液的制備(1)對照品溶液：精密稱取龍膽苦苷對照品10.79 mg、迷迭香酸對照品10.09 mg，分別置10 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，得濃度分別為1.079和1.009 mg/ml對照品儲備液，置冰箱4 ℃保存。(2)供試品溶液：取25粒扶正平消膠囊內(nèi)容物研磨混勻，精密稱取5.00 g于100 ml具塞錐形瓶中，精密加入50 ml 50%甲醇，超聲處理1 h。放冷，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。(3)陰性對照溶液：以相同比例，按扶正平消膠囊制備工藝制備不含龍膽、夏枯草的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

2.3系統(tǒng)適應(yīng)性實驗按2.1項下條件，將對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液分別進(jìn)樣，得色譜圖見圖1，龍膽苦苷及迷迭香酸分離良好，分離度>1.5， 理論塔板數(shù)>5000， 對稱因子為0.95～1.05。

圖1　扶正平消膠囊的HPLC譜圖Figure 1　HPLC photograms of Fuzhengpingxiao capsulesA：陰性對照溶液；B：對照品溶液；C：供試品溶液；1:龍膽苦苷；2:迷迭香酸

制劑中其他成分對待測峰無干擾。

2.4線性關(guān)系的考察采用逐級稀釋法，精密量取龍膽苦苷和迷迭香酸對照品溶液適量，置于10 ml量瓶中，加入甲醇定容，得龍膽苦苷對照品濃度分別為6.75、13.49、26.98、53.95、107.9、215.8、431.6 μg/ml，迷迭香酸對照品濃度分別為3.16、6.31、12.61、25.23、50.45、100.9、201.8 μg/ml的混合對照品溶液。按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，以濃度為橫坐標(biāo)(X)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為龍膽苦苷：Y1=6.244 6X1+0.817 5(r=1.000)，在6.75～431.6 μg/ml范圍內(nèi)線性良好；迷迭香酸：Y2=9.448 4X2-2.080 8(r=1.000)，在3.16～201.8 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度實驗取龍膽苦苷和迷迭香酸濃度分別為13.49、107.9、431.6 μg/ml及6.31、50.45、201.8 μg/ml的混合對照品溶液作為低、中、高3個濃度點(diǎn)，按2.1項下色譜條件，在1 d內(nèi)分別進(jìn)樣3次，連續(xù)3 d分別進(jìn)樣，考察日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果龍膽苦苷日內(nèi)精密度RSD值分別為1.18%、0.91%、0.29%(n=3)，日間精密度分別為1.63%、2.00%、0.59%(n=3)；迷迭香酸日內(nèi)精密度分別為1.12%、0.33%、0.43%(n=3)，日間精密度分別為1.95%、1.06%、0.43%(n=3)。兩者在3個不同濃度的日內(nèi)、日間精密度符合方法學(xué)要求。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性實驗精密稱取6份扶正平消膠囊(批號20140101)，按2.2(2)項下方法制備供試品溶液，按照2.1項色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果測得龍膽苦苷平均濃度為177.46 μg/ml，RSD為2.51%(n=6)；迷迭香酸平均濃度為22.68 μg/ml，RSD為1.78%(n=6)，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.7加樣回收率實驗精密稱取6份扶正平消膠囊(批號20140101)，每份5.00 g，置100 ml具塞錐形瓶中，精密加入龍膽苦苷對照品6.37 mg，迷迭香酸對照品2.018 mg，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，計算加樣回收率。結(jié)果龍膽苦苷回收率為(100.89±2.25)%；迷迭香酸回收率為(98.19 ±1.13)%(n=6)。

2.8穩(wěn)定性實驗精密稱取扶正平消膠囊(批號20140101)，按2.2(2)項下方法制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，結(jié)果龍膽苦苷和迷迭香酸峰面積RSD為1.75%和0.28%(n=5)，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9樣品含量測定精密稱取3份扶正平消膠囊(批號20140101)，按2.2(2)項下方法制備供試品溶液，在2.1項色譜條件下進(jìn)樣測定，以峰面積按外標(biāo)法計算含量，得扶正平消膠囊中龍膽苦苷含量為(1.775±0.027 3) mg/g(n=3)；迷迭香酸含量為(0.227±0.003 8) mg/g(n=3)。

3討論

3.1提取條件的考察為有效提取扶正平消膠囊中的龍膽苦苷及迷迭香酸，作者首先選用D-101大孔吸附樹脂，以10%、30%、60%、80%乙醇解吸，發(fā)現(xiàn)60%乙醇可以將兩種待測物全洗脫下來，但該法也存在影響因素較多、耗時較長的缺點(diǎn)。接著考察了超聲提取法，分別以純甲醇、50%甲醇、純乙醇、50%乙醇作為提取溶劑，結(jié)果表明50%甲醇溶液提取效果最好。又以50%甲醇超聲提取30、60、90 min，結(jié)果表明60 min和90 min提取效率基本相同，故最終確定以50%甲醇水溶液超聲提取60 min為制劑樣品提取條件。

3.2檢測波長的選擇預(yù)實驗考察了270～330 nm多個波長，最終選擇280 nm作為檢測波長，該波長下制劑中其他物質(zhì)對測定無干擾。

3.3流動相的選擇作者分別考察了乙腈-水(含0.1%甲酸)系統(tǒng)、甲醇-水(含0.1%甲酸)系統(tǒng)、乙腈-水(含0.1%磷酸)系統(tǒng)、甲醇-水(含0.1%磷酸)系統(tǒng)作為流動相。結(jié)果表明，以乙腈-水(含0.1%甲酸) 梯度洗脫，檢測波長為280 nm時，基線穩(wěn)定，靈敏度高，待測峰峰形及分離效果均良好。

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[修回日期]2015-11-10

[本文編輯]陽凌燕

·論著·

Simultaneous determination of gentiopicroside and rosmarinic acid in Fuzhengpingxiao capsules by HPLC method

WANG Hui, LI Yang, ZHOU YanNi, FEI Yang, WAN HeLin, ZHANG GuoQing*(Department of Pharmacy,Eastern Hepatobilliary Surgery Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200438, China)

[ABSTRACT]Objective: To establish a HPLC method for simultaneous determination of gentiopicroside and rosmarinic acid in Fuzhengpingxiao capsules. Methods:Agilent Eclipse XDB-C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) was used for separation. Mobile phase was composed of 0.1% formic acid(A)-acetonitrile(B) in gradient elution at a flow rate of 1.0 ml/min:0-5 min 88% A, 5-10 min 88%-82% A,10-15 min 82%-70% A, 15-20 min 70%-60% A. The column temperature was 25 ℃ and the detection wavelength was 280 nm.Results:The calibration curves of gentiopicroside and rosmarinic acid showed good linearity in the ranges of 6.75-431.6 μg/ml(r=1.000) and 3.16-201.8 μg/ml(r=1.000), respectively. The results of intra-day and inter-day precisions were both within 2% (n=3). The average additional recovery rates were (100.89±2.25)% and (98.19±1.13)% (n=6), respectively. Conclusion:The HPLC method proves to be simple, accurate and reproducible. It could be used for quality control of gentiopicroside and rosmarinic acid in the preparation of Fuzhengpingxiao capsules.

[KEY WORDS]gentiopicroside;rosmarinic acid;content determination; Fuzhengpingxiao capsule;chromatography,high performance liquid

[收稿日期]2014-12-24

通信作者*(Corresponding author): 張國慶，E-mail:guoqingzhang91@126.com

作者簡介王慧(女)，碩士，主管藥師.

DOI：10.5428/pcar20150612

[中圖分類號]R927.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1671-2838(2015)06-0436-03