張人杰，柴逸峰，朱臻宇*，沈曉航

[1.第二軍醫(yī)大學藥學院藥物分析學教研室，上海市藥物(中藥)代謝產物研究重點實驗室，上海 200433；2.上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司生物分析部，上海 200131]

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用HPLC-MS/MS法測定人血漿中曲唑酮的濃度

張人杰1，2，柴逸峰1，朱臻宇1*，沈曉航2*

[1.第二軍醫(yī)大學藥學院藥物分析學教研室，上海市藥物(中藥)代謝產物研究重點實驗室，上海 200433；2.上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司生物分析部，上海 200131]

[摘要]目的：建立HPLC-MS/MS法測定人血漿中曲唑酮的濃度。方法：血漿樣品經(jīng)蛋白質沉淀法進行前處理后，以甲醇-水-醋酸銨-甲酸為流動相體系梯度洗脫，采用CAPCELL PAK C18MG色譜柱分離，流速為0.4 ml/min,柱溫為50 ℃。采用正離子多反應監(jiān)測模式進行監(jiān)測，以電噴霧離子源作為電離技術。結果：曲唑酮濃度在10.0～3000 ng/ml范圍內線性關系良好(r=0.996 9)，平均提取回收率為97.5%，批內、批間RSD均≤8.2%(n=6)。結論：此方法專屬、靈敏、準確、簡單、快速，適用于曲唑酮臨床生物樣本的分析和研究。

[關鍵詞]曲唑酮；人血漿；色譜法，高效液相；串聯(lián)質譜法；蛋白質沉淀

[Pharm Care Res，2015，15(6): 439-442]

E-mail:nkzhangrenjie@163.com

曲唑酮(trazodone,TRZ)是三唑并吡啶衍生物，化學名為2-3-[4-(3-氯苯基)-1-哌嗪基]丙基]-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡啶-3(2H)-酮單鹽酸鹽。它屬于第二代非三環(huán)類抗抑郁藥，嚴重藥品不良反應發(fā)生率很低[1,2]。TRZ為特異性5-羥色胺再攝取抑制劑，具有α1腎上腺素能拮抗作用和抗組胺作用[3]。雖然TRZ應用已有40多年，其作用機制仍有部分未知。與傳統(tǒng)三環(huán)類抗抑郁藥相比，TRZ效力較弱但選擇性較強，在低劑量時(25～100 mg)，作為5-羥色胺受體拮抗劑，藥物作用主要為催眠[2]；在高劑量時(150～600 mg)，作為5-羥色胺受體激動劑，主要作用為抗抑郁[3-5]。

目前有一些關于TRZ在生物基質中濃度測定的方法學文獻報道，如高效液相色譜熒光檢測法[6]、高效液相色譜紫外檢測法[7]、氣相色譜-質譜聯(lián)用、液相色譜-質譜聯(lián)用[1]?，F(xiàn)有方法存在靈敏度低、色譜洗脫時間長[4,6-8]，取樣量較大[1,6]，前處理繁瑣或者成本過高[4,7-9]等缺陷，阻礙了曲唑酮日常高通量樣品分析的順利開展。本研究建立了一種專屬、靈敏、準確、簡單、快速的HPLC-MS/MS法，并將其成功運用于曲唑酮在人血漿中的含量測定。

1儀器和試藥

1.1儀器島津20系列液相色譜和柱溫箱(日本島津公司)；Waters acquity超高壓液相色譜(帶自動進樣器，美國Waters公司)；API 4000質譜、Analyst v1.4.2液相與質譜進樣控制軟件(美國Applied Biosystems 公司)；數(shù)據(jù)處理軟件為Watson LIMS v7.2.0.02(美國賽默飛世爾科技公司)；CP225D十萬分之一電子分析天平(瑞士Sartorius公司)。

1.2試藥TRZ對照品(批號 16-ANR-191-1，含量98%)和TRZ-d6對照品(氘代內標，批號2-STR-57-3，含量98%)購自Toronto Research Chemicals Inc；電動分液器(德國Eppendorf公司)； 甲醇、乙腈、異丙醇(德國Merck公司)和丙酮、乙酸乙酯、甲酸(美國Sigma-Aldrich公司)為色譜純，醋酸銨為分析純(國藥集團)，實驗用水是去離子水，人血漿(K2EDTA抗凝)購自Bioreclamation Inc。

2方法和結果

2.1色譜條件色譜柱：CAPCELL PAK C18MG 柱(50 mm×2.0 mm，5 μm，日本資生堂公司)；流動相A：2 mmol/L醋酸銨水溶液(含0.1% 甲酸)，B：含0.1%甲酸的甲醇溶液。采用梯度洗脫， 0.1～1.2 min，30%→55% B;1.2～1.3 min,55%→95%B；1.3～1.8 min，保持95%B；1.8～1.9 min，95%→30% B；1.9～2.6 min， 保持30% B，結束梯度。分析總時間2.6 min，流速：0.4 ml/min。進樣量：液相色譜10 μl，柱溫50 ℃，自動進樣器溫度4 ℃。

2.2質譜條件正離子模式；采用電噴霧離子源(ESI)；多反應監(jiān)測模式(MRM)；TRZm/z372.3→176.5，TRZ-d6m/z378.3→182.4；離子噴霧電壓：5500 V，氣簾氣：30 V，離子源氣體1：310.3 kPa (45 psi,1 psi=6.895 kPa)，離子源氣體2：310.3 kPa，溫度：550 ℃，加熱板塊為開，碰撞激發(fā)的分裂：5 units，碰撞池出口電壓：10 V，停留時間200 ms，去簇電壓：70 V，碰撞電壓：35 eV，Q1與Q3分辨率設置為unit。

2.3對照品溶液的配制精密稱取TRZ和TRZ-d6對照品適量，用電動分液器精確移取甲醇，配制成濃度為1 mg/ml的TRZ和TRZ-d6儲備液。用甲醇-水(1∶1，V∶V)稀釋TRZ-d6儲備液，配制成濃度為200 ng/ml的內標TRZ-d6工作溶液,儲存在≤-15 ℃冰箱中。

2.4血漿樣品的處理向96孔板中精密加入50 μl血漿樣品，精密加入內標TRZ-d6工作溶液50 μl，再加入400 μl含0.1%甲酸的甲醇-乙腈(1∶1,V∶V)溶液，將板封存并渦旋10 min。將96孔板在4 ℃下以3.22×103×g離心10 min,取上層清液100 μl加入另一96孔板，再加入300 μl含0.1%甲酸的水溶液,將板封存并渦旋5 min，進行LC-MS/MS分析。

2.5方法學驗證

2.5.1方法專屬性在2.1項色譜條件下測得的色譜圖見圖1， TRZ和TRZ-d6保留時間均為

圖1　曲唑酮和氘代曲唑酮的HPLC-MS/MS譜圖Figure 1　HPLC-MS/MS photograms of trazodone(TRZ) and trazodone-d6(TRZ-d6)A:空白血漿;B:空白血漿中加入200 ng/ml TRZ-d6;C:空白血漿中加入10.0 ng/ml TRZ和200 ng/ml TRZ-d6;A1、B1、C1：TRZ通道；A2、B2、C2：TRZ-d6通道

1.11 min， 空白血漿中內源性物質不干擾TRZ及TRZ-d6的測定。

2.5.2線性范圍和定量下限取TRZ儲備液，用人空白血漿序列稀釋得濃度為10.0、20.0、50.0、200、400、1000、2700、3000 ng/ml的TRZ血漿樣品，按2.4項下方法操作分析，以TRZ濃度(X)為橫坐標，TRZ峰面積與TRZ-d6峰面積比值為縱坐標(Y)，采用1/x2為校正因子，最小二乘法進行回歸，得回歸方程為：Y=0.002 015X+0.002 145 (r=0.998 4)，線性范圍在10.0～3000 ng/ml，定量下限為10.0 ng/ml。

2.5.3準確度和精密度實驗TRZ儲備液用人血漿序列稀釋配制TRZ質控樣品，定量下限、低濃度、幾何平均值、算術平均值、高濃度5個濃度分別為10.0、30.0、150、1500、2400 ng/ml的血漿樣品，按2.4項下方法操作，每一濃度進行6樣本分析，測定連續(xù)3 d的批內、批間精密度與準確度。準確度以方法回收率表示，計算實測濃度與加入濃度的比值即為方法回收率，結果見表1。

表1　準確度和精密度實驗結果

2.5.4基質效應和提取回收率配制低、中(算術平均值)、高3個濃度(30.0、1500、2400 ng/ml)的血漿樣品各6份，按2.4項下方法處理并進行分析。得峰面積為Set 1。用400 μl含0.1%甲酸的甲醇-乙腈(1∶1，V∶V)處理空白血漿18份(血漿批次需與Set 1所用一致)，3.22×103×g離心10 min后取上清液100 μl，再用相應濃度對照品溶液復溶，使之濃度與Set 1待測理論濃度一致。每個濃度平行制備6份，進樣分析得峰面積為Set 2。用400 μl含0.1%甲酸的甲醇-乙腈(1∶1，V∶V)處理6個不同批次的空白血漿(各9份)，離心后取上清液100 μl再用相應濃度對照品溶液復溶，使之濃度與Set 1待測理論濃度一致。每個血漿批次每個濃度平行制備3份，進樣分析得峰面積為Set 3。按2.3項下方法配制對照品溶液，使之與Set 1待測理論濃度一致，每個濃度平行制備3份。進樣分析得峰面積為Set 4。

通過Set 3與Set 4測得的TRZ/TRZ-d6峰面積比值計算基質效應。通過Set 2與Set 1測得的TRZ和TRZ-d6峰面積計算提取回收率。結果見表2。結果表明，血漿樣品中TRZ的提取回收率>95%,且生物基質穩(wěn)定性沒有濃度依賴。

表2曲唑酮的基質效應和提取回收率實驗結果

Table 2Results of matrix effect and

recovery rate tests of trazodone

濃度(ρB/ng·ml-1)基質效應提取回收率30.099.0±0.4598.5±2.561500101.0±3.5695.1±3.80240097.0±1.1099.0±1.37

2.5.5穩(wěn)定性實驗考察TRZ在不同保存條件下的穩(wěn)定性。TRZ儲備液用人血漿分別稀釋，配制TRZ濃度為30.0、2400 ng/ml的血漿樣品，各進行6樣本分析。結果表明，TRZ血漿樣品在室溫下放置29 h、經(jīng)過5次凍融循環(huán)(從-15 ℃至室溫)、長期冷凍(≤-15 ℃)28 d、處理后放置自動進樣器(4 ℃)77.7 h后穩(wěn)定，RSD均<15%(n=6)。

3討論

本研究建立的方法前處理簡單、快捷，成本低廉；基質效應與回收率沒有濃度依賴且重現(xiàn)性好；每針保留時間僅2.6 min，可方便應用于日常高通量樣品分析；進樣體積小，對于維持柱效和色譜柱壽命比較有利；前處理只需50 μl人血漿樣品，和現(xiàn)有文獻300 μl[6]、500 μl[1]相比，提高了采樣效率，減小對人體傷害，利于維持人體生理條件的穩(wěn)定且基質抑制作用小。選用TRZ的氘代化合物為內標，兩者母離子與子離子m/z均相差6，具有相同的理化性質，色譜條件下出峰時間相同，TRZ與TRZ-d6相互干擾很小，是測定TRZ含量極佳的內標化合物。綜上所述，此方法具有實際應用價值，可用于測定曲唑酮在人血漿中的濃度。

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[修回日期]2015-11-20

[本文編輯]陽凌燕

·論著·

Determination of trazodone in human plasma by HPLC-MS/MS method

ZHANG RenJie1,2， CHAI YiFeng1，ZHU ZhenYu1*，SHEN XiaoHang2*[1.Department of Pharmaceutical Analysis, School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai Key Laboratory for Pharmaceutical(Chinese Materia Medica) Metabolites Research,Shanghai 200433,China; 2. Bioanalytical Services,WuXi AppTec. Co.,Ltd(Shanghai), Shanghai 200131，China]

[ABSTRACT]Objective: To establish a HPLC-MS/MS method for the determination of trazodone (TRZ) in human plasma. Methods: The plasma samples were treated by protein precipitation and separated in CAPCELL PAK C18MG column with a mobile phase of methanol-water-ammonium acetate-formic acid under gradient conditions.The flow rate was 0.4 ml/min and column temperature was 50 ℃. Detection was performed in positive ion and multiple reaction monitoring (MRM) acquisition mode with electrospray ion source(ESI) as the ionization technique. Results: TRZ displayed good linearity within the ranges of 10.0-3000 ng/ml(r=0.996 9). Mean extraction recovery rate was 97.5%. The intra-batch and inter-batch relative standard deviation (RSD) was≤8.2% (n=6). Conclusion: The HPLC-MS/MS method is specific,sensitive,accurate,simple and rapid, which could be used for analysis and research of TRZ in biospecimens.

[KEY WORDS]trazodone;human plasma;chromatography,high performance liquid;tandem mass spectrometry;protein precipitation

[收稿日期]2015-01-12

通信作者*(Corresponding author)：朱臻宇，E-mail:zzyzyfzhu@163.com；沈曉航，E-mail:shenxiaohang@wuxiapptec.com

作者簡介張人杰(女)，副研究員.

基金項目國家自然科學基金(81273474)

DOI：10.5428/pcar20150613

[中圖分類號]R927.2

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-2838(2015)06-0439-04