顏繼忠，陳　岑，楚　楚，李行諾，吳瓊瓊

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

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生脈飲(黨參方)中5-羥甲基糠醛的分離及其來源探究

顏繼忠，陳岑，楚楚，李行諾，吳瓊瓊

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

摘要：為探討生脈飲(黨參方)的物質(zhì)基礎(chǔ)及配伍規(guī)律，采用大孔樹脂富集結(jié)合中壓柱色譜純化，從生脈飲(黨參方)中分離得到5-羥甲基糠醛.通過進一步的拆方研究發(fā)現(xiàn)：在含五味子的合煎組中，5-羥甲基糠醛的量均較單煎組有明顯提高.推測生脈飲(黨參方)中麥冬及/或黨參與五味子的合煎過程可能會產(chǎn)生5-羥甲基糠醛.首次從生脈飲(黨參方)中分離鑒定出5-羥甲基糠醛，同時提供了一種從中藥復(fù)方中快速分離5-羥甲基糠醛的方法，并對生脈飲(黨參方)的配伍規(guī)律進行了初步探索.

關(guān)鍵詞：生脈飲(黨參方)；5-羥甲基糠醛；分離；配伍規(guī)律

生脈飲(黨參方)是我國古代名方生脈散衍生而來，由黨參、麥冬和五味子組成，具有益氣、養(yǎng)陰生津之功效，現(xiàn)載于衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第十冊[1].與經(jīng)典生脈方相比，本方以黨參代替人參，行補益肺氣之功，更側(cè)重于生津養(yǎng)血[2].現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：生脈飲(黨參方)具有保護心肌，改善心功能，增加冠脈血流量等功效[3].

目前，生脈飲(黨參方)的研究報道不多，主要集中于單味藥材的化學(xué)成分的分離鑒定及質(zhì)量控制[4-6]，尚未見從生脈飲(黨參方)復(fù)方中分離純化化學(xué)成分的報道.通過前期研究發(fā)現(xiàn)，生脈飲(黨參方)中存在一含量較高的成分，但該成分在單味藥材中含量極低，推測可能是在復(fù)方煎煮過程中產(chǎn)生.為準確鑒定該成分，深入探究生脈飲(黨參方)的物質(zhì)基礎(chǔ)，筆者采用大孔樹脂富集結(jié)合中壓柱色譜，對生脈飲(黨參方)浸膏進行分離純化.同時，通過拆方分析對其來源進行分析，為進一步研究生脈飲(黨參方)的配伍規(guī)律提供依據(jù).

1儀器、材料與試劑

BUCHI Sepacore中壓柱色譜(瑞士步琦有限公司)，N2000色譜工作站(賽智科技有限公司)，KQ3200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，AR224w電子天平(奧豪斯儀器有限公司)，HH4恒溫水浴鍋(上海森信實驗儀器有限公司)，Agilent 1260高效液相色譜儀(Agilent Technologies, USA).

黨參、麥冬和五味子藥材由正大青春寶藥業(yè)有限公司提供，5-羥甲基糠醛對照品購于成都曼斯特生物科技有限公司(批號MUST-13110805)，D-101大孔吸附樹脂(滄州寶恩化工有限公司)，C18填料(YMC﹡GEL ODS-A，孔徑120 μm，粒徑50 μm).

甲醇(色譜純，TEDIA)，乙腈(色譜純，TEDIA)，甲酸(色譜純，上海阿拉丁試劑有限公司)，乙醇(分析純，成都市科龍化工試劑廠).

2方法與結(jié)果

2.1生脈飲(黨參方)中5-羥甲基糠醛的分離鑒定

2.1.1水煎液浸膏的獲得

水煎液浸膏由正大青春寶藥業(yè)有限公司提供，按照衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第十冊生脈飲項下制得[1]，即分別取黨參300 g，麥冬200 g，五味子100 g，加水煎煮二次，第一次2 h，第二次1.5 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮成稠浸膏，即得水煎液浸膏.

2.1.2大孔樹脂富集

取D101大孔樹脂約60 mL，置100 mL燒杯中，用95%乙醇浸泡約24 h，濕法裝柱(柱規(guī)格為25 mm×420 mm)，以大量蒸餾水洗至流出液無醇味，待用.取2.1.1中生脈飲(黨參方)水煎液浸膏適量，加水制成0.17 g/mL的樣品溶液，采用經(jīng)預(yù)處理后的D101大孔樹脂初步分離，上樣后于室溫下靜吸附1～2 h，先以水洗脫5倍柱體積，除去水溶性雜質(zhì)，再用30%乙醇10倍柱體積洗脫，流速為1 mL/min，收集30%乙醇洗脫液，回收溶劑，即得大孔樹脂富集物100.5 mg，用于中壓柱色譜進一步分離.

2.1.3中壓柱色譜分離純化

采用中壓柱系統(tǒng)分離，中壓柱色譜條件：Buchi Plastic+Glas鍍膜色譜柱(49 mm×230 mm)，以C18填料裝柱，柱溫25 °C，流速20 mL/min，檢測器波長254 nm，流動相為V(甲醇)∶V(水)=14∶86.

稱取大孔樹脂富集物496.9 mg，溶于20 mL體積比為14%的甲醇水溶液中，搖勻，離心，取上清液作為供試品溶液進樣，以14%甲醇水溶液洗脫，流速20 mL/ min，紫外檢測，波長254 nm，收集色譜圖中保留時間25～32 min的餾分，減壓濃縮，冷凍干燥，得到浸膏148.8 mg.中壓柱色譜圖如圖1所示.

圖1　生脈飲(黨參方)分離純化后的中低壓色譜圖Fig.1　Chromatogram of Shengmaiyin (Dangshenfang) separation by medium-pressure chromatography

2.1.4化合物鑒定及質(zhì)量分數(shù)測定

所獲流分與對照品的液相色譜保留時間一致，外標法測定其質(zhì)量分數(shù)為96.3%(圖2).同時，氫譜信號與文獻報道一致[7]，主要信號的歸屬如下：1HNMR(MeOD, 500 MHz)δ：3.33(1H, m, -OH)，4.63(2H, s, -CH2OH)，6.60(1H, d,J=3.5 Hz, Furan-H-4)，7.40(1H, d,J=3.5 Hz, Furan-H-3)，9.55(1H, s, -CHO)，故鑒定該化合物為5-羥甲基糠醛.

圖2　5-羥甲基糠醛的高效液相色譜圖Fig.2　HPLC chromatogram of 5-hydroxymethylfurfural

2.25-羥甲基糠醛來源探究

2.2.1拆方組樣品制備

按衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第十冊生脈飲(黨參方)中組方比例，即黨參、麥冬和五味子質(zhì)量比為3∶2∶1，進行拆方研究，設(shè)置以下7個拆方組，A：黨參3 g，B：麥冬2 g，C：五味子1 g，D：黨參 3 g+五味子1 g，E：黨參3 g +麥冬2 g，F(xiàn)：麥冬2 g +五味子1 g，G：黨參3 g +麥冬2 g +五味子1 g，以上7組拆方藥材，分別加20倍水浸泡1 h，置水浴鍋回流煎煮，第一次煎煮2 h，過濾；濾渣繼續(xù)加20倍水煎煮1.5 h，合并濾液，濃縮定容至10 mL，待測.以上各拆方組樣品平行制備3份.

2.2.2液相色譜條件

根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果[8]，液相色譜條件：色譜柱為Agilent Extend C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相及梯度洗脫程序如表1所示，流速1 mL/min進樣量10 μL，柱溫25 °C，檢測波長為254 nm.代表性的液相色譜圖如圖3所示.

2.2.3標準曲線的繪制

稱取5-羥甲基糠醛對照品適量，配制成質(zhì)量濃度為0.431 0 mg/mL的對照品溶液.精密吸取該溶液2，4，8，12，16 μL，稀釋25倍的對照品溶液16 μL注入液相色譜，測得峰面積.以進樣量x為橫坐標、峰面積y為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為y=1 529.9x+42.6，R2=0.999 9，線性范圍是0.172 0～6.896 0 μg.

表1　梯度洗脫程序

2.2.45-羥甲基糠醛來源探究

將2.2.1中制備的7個不同拆方組的樣品，按照2.2.2的色譜條件檢測，結(jié)果見表2.

表2　不同拆方組含有的5-羥甲基糠醛質(zhì)量的測定結(jié)果

3討論

3.1大孔樹脂富集條件及中低壓制備色譜條件的優(yōu)化

采用D101型大孔吸附樹脂對目標成分進行富集.對上樣液的濃度、流速、洗脫梯度和洗脫劑的體積等因素進行了初步考察，結(jié)果表明：上樣液濃度為0.17 g/mL，流速為1 mL/min，以30% 乙醇洗脫10倍柱體積為較優(yōu)的富集條件.

采用中低壓制備色譜進行純化，對中壓柱的色譜條件如柱溫、流速、流動相和洗脫梯度等進行了考察.較優(yōu)的中低壓制備色譜條件：柱溫25 °C，流速20 mL/min，流動相為V(甲醇)∶V(水)=14∶86.

3.2一種快速分離制備5-羥甲基糠醛的方法

采用大孔樹脂富集結(jié)合中低壓制備色譜對生脈飲(黨參方)浸膏進行分離純化，得到5-羥甲基糠醛，這是首次從生脈飲(黨參方)中分離獲得該物質(zhì).同時，此分離制備的策略快速，高效，便捷，溶劑環(huán)境友好，提供了一種從中藥復(fù)方中快速分離制備5-羥甲基糠醛的方法.

3.3拆方研究結(jié)果及5-羥甲基糠醛來源分析

實驗結(jié)果顯示，麥冬、五味子和黨參中均含有5-羥甲基糠醛，含有的量為麥冬>五味子>黨參.而當麥冬或/及黨參與五味子合并煎煮后，含有5-羥甲基糠醛的量為麥冬+五味子合煎組>麥冬組+五味子組，黨參+五味子合煎組>黨參組+五味子組，三味合煎組>黨參組+麥冬組+五味子組，而黨參+麥冬合煎組<黨參組+麥冬組.結(jié)果表明：在含五味子的合煎組中，5-羥甲基糠醛的量均較單煎組有明顯提高.

5-羥甲基糠醛被認為是中藥材及中藥復(fù)方中常見的成分之一.文獻報道其具有神經(jīng)毒性，損害人體橫紋肌及內(nèi)臟，同時會對眼黏膜、上呼吸道黏膜等產(chǎn)生刺激作用[9].《中國藥典》中將其作為中藥注射液中的雜質(zhì)進行嚴格控制[10].但近年來研究卻發(fā)現(xiàn)其可能是一種隱藏在單味藥及復(fù)方背后、尚未被人們認識的活性成分.如有報道稱5-羥甲基糠醛也具有抗氧化、改善血液流變學(xué)等對人體有益的生物活性[11-12].同時，可能是經(jīng)典的生脈方——生脈散發(fā)揮抗心肌缺血作用的藥效成分[13].該成分會產(chǎn)生于中藥材的炮制及中藥復(fù)方的配伍過程中[14-15].其產(chǎn)生的機理通常被認為是由果糖、葡萄糖以及以其為基本結(jié)構(gòu)單元的二糖和多糖熱解而得，同時有機酸的加入可以增加高溫液態(tài)水的酸強度，促進糖類轉(zhuǎn)化成5-羥甲基糠醛的過程[16-17].因此，筆者推測，生脈飲(黨參方)中5-羥甲基糠醛可能是由黨參或麥冬中的多糖在五味子提供的酸性環(huán)境下發(fā)生水解產(chǎn)生，但還有待進一步實驗研究.

4結(jié)論

首次報道了從生脈飲(黨參方)中分離制備5-羥甲基糠醛，提供了一種以中藥復(fù)方為原料制備5-羥甲基糠醛的新途徑，而5-羥甲基糠醛作為一種藥理活性有爭議的物質(zhì)，其在中成藥中的存在與否及含量高低均應(yīng)引起足夠的重視.

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(責任編輯：陳石平)

Separation and source of 5-hydroxymethylfurfural in

Shengmaiyin (Dangshenfang)

YAN Jizhong, CHEN Cen, CHU Chu, LI Xingnuo, WU Qiongqiong

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Abstract:To investigate the material base and compatibility law of Shengmaiyin (Dangshenfang), macroporous resin column chromatography combined with medium-pressure chromatography were applied to separate the chemical constituents from Shengmaiyin (Dangshenfang). As a result, a kind of constituents was isolated and identified as 5-hydroxymethylfurfural through1HNMR in the present study. Furthermore, the origin of 5-hydroxymethylfurfural was investigated by decomposing recipes of Shengmaiyin (Dangshenfang). The result showed that the content of 5-hydroxymethylfurfural in single drug was much lower than con-decocting of two or three drugs which contained Schisandrae Fructus. It can be concluded that the con-decocting procedure of Codonopsis Radix and/or Ophiopogonis Radix with Schisandrae Fructus may produced 5-hydroxymethylfurfural. Our study presented the first report on isolation of 5-hydroxymethylfurfural from Shengmaiyin (Dangshenfang). In addition, a rapid and effective method was developed to separate 5-hydroxymethylfurfural from Chinese medicinal formula was established. Moreover, the compatibility law of Shengmaiyin (Dangshenfang) was explored.

Keywords:Shengmaiyin (Dangshenfang); 5-hydroxymethylfurfural; separation; law of compatibility

文章編號：1006-4303(2015)04-0379-04

中圖分類號：R932

文獻標志碼：A

作者簡介：顏繼忠(1964—)，男，福建永春人，教授，研究方向為天然藥物有效成份的提取分離與質(zhì)量控制，E-mail: yjz@zjut.edu.cn.

收稿日期：2015-02-03