丙烯腈降解菌的篩選及應(yīng)用研究

林春綿，楊浩，魏敏，郭亞萍

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

摘要：從處理丙烯腈廢水的活性污泥中，以丙烯腈為惟一的氮源逐步富集，篩選到一株具有丙烯腈降解能力的菌株YH-5，通過(guò)菌落形態(tài)、生理生化指標(biāo)以及細(xì)菌16S rDNA分子鑒定，初步確定該菌株為節(jié)桿菌屬.對(duì)菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：葡萄糖20 g/L，酵母浸膏5 g/L，己內(nèi)酰胺4 g/L，K2HPO4 0.5 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，MgSO4 0.5 g/L，初始pH 7.0，在30 ℃，150 r/min下，培養(yǎng)60 h，菌體酶活為15.44 U/g DCW；在該條件下，對(duì)初始質(zhì)量濃度分別為341.4，624.9，1 205.1，1 829.8 mg/L的丙烯腈均具有較好的降解效果.

關(guān)鍵詞：丙烯腈；節(jié)桿菌；生物降解

收稿日期：2015-04-23

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(51108416)；浙江省科技廳重大專項(xiàng)國(guó)際合作項(xiàng)目(2011C14023)

作者簡(jiǎn)介：林春綿(1962—)，男，浙江溫州人，教授，研究方向?yàn)槲廴究刂?，E-mail：lcm@zjut.edu.cn.

中圖分類號(hào)：TQ085`+.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-4303(2015)05-0527-05

Abstract:An acrylonitrile isolate named YH-5 through enrichment screening from the activated sludge of treating acrylonitrile wastewater was identified as Arthrobacter spby analyzing the colony morphology, physiological and biochemical characteristics, and 16S rDNA sequence.The medium composition and the culture conditions were optimized and the results were as follows：glucose 20 g/L,yeast extract 4 g/L,caprolactam 5 g/L, K2HPO4 0.5 g/L, KH2PO4 0.5 g/L, MgSO4 0.5 g/L ,initial pH value 7.0, 30 ℃, 150 r/min.When cultured under the above conditions after 60 h, the nitrile hyddratase activity could reach 15.44 U/g DCW and when the initial concentration of acrylonitrile was 341.4, 624.9, 1 205.1 or 1 829.8 mg/L, the degradation effect was preety good.

Keywords:acrylonitrile; Arthrobacter sp; biodegradation

Screening of an acrylonitrile degradation strain and its application

LIN Chunmian, YANG Hao, WEI Min, GUO Yaping

(College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

丙烯腈是三大工業(yè)合成材料生產(chǎn)中最重要的一種單體.2013年我國(guó)丙烯腈總產(chǎn)能為138萬(wàn)t/a，產(chǎn)量約為128萬(wàn)噸，而丙烯腈總消費(fèi)量約為180萬(wàn)噸[1].隨之而來(lái)的是，丙烯腈廢水排放的問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，如不對(duì)其加有效處理，將會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染，危害人類健康.丙烯腈廢水是一種難降解的高濃度的有機(jī)廢水，如何有效地處理一直是丙烯腈企業(yè)的困擾[2].相比于丙烯腈廢水處理的物化法，生物法處理有著反應(yīng)條件溫和，處理能耗低，二次污染少等優(yōu)點(diǎn)，但是因?yàn)楸╇鎻U水的成分復(fù)雜且多數(shù)污染物具有生物毒性，可能對(duì)微生物產(chǎn)生較大的沖擊，使得處理效果不穩(wěn)定.因此，獲得能降解丙烯腈的菌種有利于提高生物法處理的耐沖擊性，使整個(gè)處理系統(tǒng)能穩(wěn)定運(yùn)行.

自上世紀(jì)60年代由Thiman等從大麥葉中發(fā)現(xiàn)腈水解酶以來(lái)，越來(lái)越多能產(chǎn)腈水解酶的細(xì)菌相繼報(bào)道，主要包括紅球菌、諾卡式菌、假單胞桿菌、克雷伯氏菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、節(jié)桿菌屬等，可見其分布廣泛.在已有報(bào)道中，對(duì)一些高效的產(chǎn)腈水解酶菌株如R.rhodochrousJl[3]，Rhodococcussp. NDB 1165[4]，Alcaligenessp. ECU0401[5]，AlcaligenesfaecalisWT10[6]等的研究，均表明了腈水解酶在生物催化方面的巨大應(yīng)用潛力.目前，有關(guān)于腈水解酶細(xì)菌的研究主要針對(duì)其在生物合成領(lǐng)域的應(yīng)用，而針對(duì)含腈廢水的處理方面研究尚未見報(bào)道.本文通過(guò)以丙烯腈為唯一氮源進(jìn)行富集培養(yǎng)，然后進(jìn)行分離和純化，得到一株能合成腈水解酶的丙烯腈降解菌，對(duì)其進(jìn)行了鑒定和優(yōu)化了其培養(yǎng)條件，并初步考察了其降解丙烯腈廢水的效果.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)材料

土樣：從浙江寧波市鎮(zhèn)海區(qū)某化工廠采集的廢水處理活性污泥用以菌種篩選.

主要儀器和試劑：高壓蒸汽滅菌鍋，數(shù)顯電熱生化培養(yǎng)箱，恒溫振蕩搖床，高速冷凍離心機(jī)，Agilent氣相色譜儀，電子分析天平，pH計(jì)等，丙烯腈(99%).

1.2培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)所用各種培養(yǎng)基[7]如下：富集培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 7.0，121 ℃下滅菌20 min，丙烯腈于滅菌后加入；平板培養(yǎng)基：富集培養(yǎng)基中加入20 g/L的瓊脂；斜面培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L， NaCl 5g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母浸膏4 g/L，己內(nèi)酰胺5 g/L，K2HPO40.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 7.0.

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1丙烯腈降解菌的篩選

稱取5 g污泥于裝有50 mL富集培養(yǎng)基的搖瓶中，其中丙烯腈體積分?jǐn)?shù)為0.1%，搖床培養(yǎng)3～4 d.移取2 mL培養(yǎng)液接至新的富集培養(yǎng)基中，其中丙烯腈的體積分?jǐn)?shù)為0.2%，搖床培養(yǎng)3～4 d.重復(fù)培養(yǎng)4次后，將最后一次富集液梯度稀釋并均勻涂布于平板，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出單菌落.

從平板上挑取單菌落，將其轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)3 d后，取20 mL發(fā)酵液，于4 ℃，12 000 r/min離心8 min后，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，收集菌體待用.菌株的降解實(shí)驗(yàn)在50 mL的具口錐形瓶中進(jìn)行，反應(yīng)體系為10 mL的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7)，30 μL的丙烯腈，反應(yīng)一定時(shí)間后，滴加6 mol/L的鹽酸溶液終止反應(yīng).將反應(yīng)液離心取上清液，0.45 μm水膜過(guò)濾后進(jìn)氣相檢測(cè)丙烯腈的殘余量，計(jì)算丙烯腈的降解率.

1.3.2檢測(cè)方法

采用氣相色譜法[8]，色譜柱：FFAP毛細(xì)管柱(30 m×320 μm×0.25 μm)，色譜條件：進(jìn)樣口260 ℃，柱溫190 ℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器260 ℃，氫氣流量40 mL/min，空氣流量450 mL/min，氮?dú)馕泊禋饬髁?0 mL/min，進(jìn)樣量0.2 μL，分流比為50∶1.

1.3.3生理生化特征及16S rDNA測(cè)序

細(xì)菌生理生化鑒定參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[9]，細(xì)菌16S rDNA的測(cè)序工作委托上海生工測(cè)序公司完成.

1.3.4生物量及酶活的測(cè)定

采用干重法測(cè)定菌體的生物量.取10 mL發(fā)酵培養(yǎng)液，于4 ℃，10 000 r/min下離心10 min，置于烘箱中60 ℃下烘干至恒重，計(jì)算得出1 L發(fā)酵液中菌體的生物量.

酶活單位(U)的定義：在30 ℃、pH 7.0下，單位時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化丙烯腈生成1 μmol丙烯酸所需要的酶量定義為1個(gè)酶活單位(U).比酶活的定義：每1 g干菌體中所含有的的酶活單位，用U/g DCW表示(DCW為細(xì)菌干重).丙烯腈轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)于50 mL的具口錐形瓶中進(jìn)行.取20 mL發(fā)酵培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，收集菌體并轉(zhuǎn)移至50 mL的具口錐形瓶中，反應(yīng)體系總體積10 mL，30 μL丙烯腈，蓋上玻璃塞，30 ℃，150 r/min下反應(yīng)2.5 h.反應(yīng)結(jié)束后氣相測(cè)定丙烯酸產(chǎn)量，計(jì)算酶活.

1.3.5丙烯腈降解實(shí)驗(yàn)

細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)60 h后，向發(fā)酵液中分別加入體積分?jǐn)?shù)為0.05%，0.1%，0.2%，0.3%的丙烯腈，進(jìn)行丙烯腈降解實(shí)驗(yàn)，定時(shí)取樣GC檢測(cè)丙烯腈殘余量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

2結(jié)果與討論

2.1菌種篩選

通過(guò)以丙烯腈為惟一氮源進(jìn)行四輪富集培養(yǎng)后，將最后一次富集培養(yǎng)液梯度稀釋后涂布于富集平板培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出單菌落后，挑取顏色形態(tài)各不相同的單菌落，進(jìn)行復(fù)篩，最終得到一株丙烯腈降解菌YH-5.

2.2菌種初步鑒定

細(xì)菌在平板上的菌落形態(tài)呈乳白色，邊緣規(guī)則，菌落表面凸起且光滑，其生理生化鑒定結(jié)果結(jié)果如表1所示.

表1　生理生化試驗(yàn)結(jié)果

細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳(圖1)，回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測(cè)序公司，測(cè)得菌株YH-5的16S rDNA實(shí)際長(zhǎng)度為1 403 bp.將該序列與GeneBank中的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用ClustalX和MEGA軟件[10]制作系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，結(jié)果表明菌株YH-5的16S rDNA序列與節(jié)桿菌屬的較多細(xì)菌的同源性最高.結(jié)合菌落形態(tài)及生理生化特征，可初步判斷該菌株為節(jié)桿菌(Arthrobactersp).在已有報(bào)道中，Shen等[11]也已發(fā)現(xiàn)一株節(jié)桿菌屬內(nèi)能產(chǎn)腈水解酶的細(xì)菌.

圖1　16S rDNA基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖 Fig.1　Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR amplication products. Left: PCR amplication products　Right:DNA Maker

圖2　菌株YH-5的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.2　Phylogenetic tree by strain YH-5

2.3菌株YH-5培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1碳源質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)的影響

碳源質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)有一定的影響，濃度過(guò)低時(shí)，隨著細(xì)菌生長(zhǎng)的葡萄糖越來(lái)越少，導(dǎo)致后期缺少必需的營(yíng)養(yǎng)而使其生長(zhǎng)受到抑制；質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，可能導(dǎo)致細(xì)菌胞外滲透壓高于胞內(nèi)而不利于生長(zhǎng)，也有可能會(huì)抑制其他所需酶量的合成.圖3顯示了葡萄糖質(zhì)量濃度分別為5，10，15，20，25，30 g/L時(shí)細(xì)菌的生物量和相對(duì)酶活(以葡萄糖質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)為基準(zhǔn)).當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度低于20 g/L時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的升高，細(xì)菌的生長(zhǎng)量和酶活都逐漸提高，當(dāng)葡萄糖的質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，細(xì)菌生物量和酶活都相對(duì)較高，繼續(xù)提高葡萄糖的質(zhì)量濃度，對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和酶活略有下降，說(shuō)明葡萄糖質(zhì)量濃度過(guò)高的確對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生了抑制作用.

圖3　葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)的影響 Fig.3　Effects of glucose concentration on the bacteria growth and nitrilase activity

2.3.2氮源濃度對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)的影響

以酵母浸膏為氮源，分別配制酵母浸膏質(zhì)量濃度為2.5，5.0，7.5，10，12.5，15 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基，葡萄糖質(zhì)量濃度為20 g/L.如圖4所示，在酵母浸膏質(zhì)量濃度低于5.0 g/L時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)以及產(chǎn)酶都在比較高的水平；當(dāng)酵母浸膏質(zhì)量濃度為7.5 g/L時(shí)，細(xì)菌生物量和酶活都出現(xiàn)急劇下滑，并在較高的質(zhì)量濃度時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶都維持在一個(gè)相對(duì)較低的水平，因此說(shuō)明，酵母浸膏質(zhì)量濃度不宜過(guò)高，否則會(huì)嚴(yán)重抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)以及產(chǎn)酶.

圖4　酵母浸膏質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)的影響 Fig.4　Effects of yeast extract concentration on the bacteria growth and nitrilase activity

2.3.3添加誘導(dǎo)劑對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)的影響

在培養(yǎng)基中添加合適的誘導(dǎo)劑，往往能使細(xì)菌產(chǎn)酶能力增加.據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，腈水解酶常用的誘導(dǎo)劑有底物、產(chǎn)物或其結(jié)構(gòu)類似物如己內(nèi)酰胺等[12].當(dāng)向?qū)嶒?yàn)中添加丙烯酸時(shí)，培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基始終澄清，細(xì)菌基本不生長(zhǎng)；當(dāng)添加體積分?jǐn)?shù)為0.1%，0.2%，0.3%的丙烯腈以及2，4，6 g/L的己內(nèi)酰胺時(shí)，空白組不添加任何誘導(dǎo)劑.圖5表明：與對(duì)照組對(duì)比，添加丙烯腈時(shí)，細(xì)菌生物量以及酶活都變化不大；當(dāng)添加己內(nèi)酰胺時(shí)，細(xì)菌生物量也基本穩(wěn)定在同一水平，但是酶活得到了提高，當(dāng)己內(nèi)酰胺質(zhì)量濃度為4 g/L時(shí)，細(xì)菌酶活比對(duì)照組提高了29.2%.

圖5　誘導(dǎo)劑對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)的影響 Fig.5　Effects of inducer on the bacteria growth and nitrilase activity

2.3.4初始pH值對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)的影響

本實(shí)驗(yàn)配制了初始pH分別為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0的發(fā)酵培養(yǎng)基，圖6表明：當(dāng)pH值為6.5～7.5時(shí)，生物量較高且相對(duì)穩(wěn)定，說(shuō)明在此范圍內(nèi)，細(xì)菌生長(zhǎng)較好；當(dāng)pH為7.0時(shí)，酶活達(dá)到最高值，偏堿或偏酸的環(huán)境均不利于細(xì)菌產(chǎn)酶.

圖6　初始pH值對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)的影響 Fig.6　Effects of pH value on the bacteria growth and nitrilase activity

2.3.5細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

菌株從種子培養(yǎng)基以3%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在30 ℃，150 r/min下連續(xù)培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間測(cè)定細(xì)菌的生物量和酶活.如圖7所示，在0～24 h時(shí)，細(xì)菌能迅速適應(yīng)環(huán)境，生物量幾乎成對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，細(xì)菌處于對(duì)數(shù)期；24 h之后細(xì)菌生物量基本維持在一個(gè)較為平穩(wěn)的水平，細(xì)菌進(jìn)入穩(wěn)定期；發(fā)酵前期，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充分，細(xì)菌增殖優(yōu)先于產(chǎn)酶，細(xì)菌達(dá)到穩(wěn)定期后，酶活繼續(xù)增加，60 h時(shí)酶活達(dá)到最高.為了選擇合適的發(fā)酵時(shí)間，既能使細(xì)菌充分生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，又避免發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，根據(jù)上述生長(zhǎng)曲線，發(fā)酵時(shí)間為60 h左右最合適.

圖7　菌株YH-5生長(zhǎng)及產(chǎn)酶曲線 Fig.7　The growth of strain YH-5 and nitrilase activity changes during the culture time

2.4細(xì)菌對(duì)不同濃度丙烯腈的降解效果

細(xì)菌經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)60 h后，加入丙烯腈并測(cè)得初始質(zhì)量濃度分別為341.4，624.9，1 205.1，1 829.8 mg/L.如圖8所示，在經(jīng)過(guò)120 h后，丙烯腈的降解率分別為63.47%，60.33%，70.19%，73.12%.比較不同濃度的降解曲線可以看出初始降解速率隨著丙烯腈質(zhì)量濃度的增加而增大，從酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的角度來(lái)說(shuō)，在較低濃度范圍內(nèi)，底物丙烯腈的增加能加快反應(yīng)速率.隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)速率慢慢減小，96 h之后丙烯腈不再繼續(xù)減少，產(chǎn)物丙烯酸也不再增加.最終降解率停留在60%～70%左右，造成這一現(xiàn)象的原因，可能是由于丙烯腈的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物丙烯酸本身也是一種具有生物毒性的有機(jī)物，隨著丙烯酸的積累，會(huì)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)造成不利影響；另一方面，丙烯酸還是一種有機(jī)酸，它的積累會(huì)使體系的pH值下降，這對(duì)于酶活性的影響是不利的，導(dǎo)致酶活下降.

圖8　細(xì)菌對(duì)不同質(zhì)量濃度丙烯腈的降解 Fig.8　The biodegradation of different acrylonitrile concentration by bacteria

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從丙烯腈廢水處理的活性污泥中篩選得到一株具有丙烯腈降解能力的菌株.結(jié)合菌株YH-5的菌落形態(tài)、生理生化指標(biāo)以及細(xì)菌16S rDNA分子的鑒定，初步鑒定其為節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp).通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，結(jié)果表明：葡萄糖20 g/L，酵母浸膏5 g/L，己內(nèi)酰胺4 g/L，K2HPO40.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO40.5 g/L，初始pH 7.0，30 ℃，150 r/min，最適發(fā)酵時(shí)間為60 h左右.在此最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)得到的細(xì)菌，酶活為15.44 U/g DCW，比優(yōu)化前提高了約52%.還研究了菌株YH-5在最適培養(yǎng)條件下擴(kuò)培之后，對(duì)不同質(zhì)量濃度丙烯腈的降解情況.當(dāng)丙烯腈質(zhì)量濃度分別為341.4，624.9，1 205.1，1 829.8 mg/L時(shí)，在經(jīng)過(guò)120 h的降解后，降解率分別為63.47%，60.33%，70.19%，73.12%.

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(責(zé)任編輯：劉巖)