張傳杰，　梁　超，　孫長策，　許　潔，　陸怡超，　曹雪琛，　黃飛揚，　李　普，　秦　超

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前列腺癌專題

外周血循環(huán)腫瘤細胞對前列腺癌預后判斷價值的研究

張傳杰，梁超，孫長策，許潔，陸怡超，曹雪琛，黃飛揚，李普，秦超

第一作者： 張傳杰，男，本科在讀，研究方向：泌尿、男生殖系腫瘤，E-mail：18351978361@163.com

【摘要】前列腺癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，居男性腫瘤特異性死亡率的第二位，且呈逐年上升趨勢。相當一部分患者確診時已失去手術治療的最佳機會，這部分患者雖對內(nèi)分泌治療(去雄)有初效，但最終可發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer，CRPC)。該類患者預后差，對治療反應差異性大，中位生存時間數(shù)1～2年，且對治療預后的評判也難以量化明確。近年來，循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)檢測計數(shù)，甲基化表型分析及標記物檢測等研究對于腫瘤細胞遷移，預后評估，個體化治療顯現(xiàn)出重要意義。因此，作者就CTCs的總體概況及目前在前列腺癌中的臨床應用進行總結(jié)，為CRPC的個體化治療方向提供參考。

【關鍵詞】前列腺癌；去勢抵抗性前列腺癌；循環(huán)腫瘤細胞；檢測；表觀甲基化；腫瘤標志物

過去幾年中，在轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌(metastatic castration resistant prostate cancer,mCRPC)的治療方面呈現(xiàn)了長足的進步，例如阿比特龍、恩雜魯胺、卡巴他賽、鐳-233等藥物在延長mCRPC患者生存方面證明有效[1]。但由于缺乏亞群預后的精確判斷方法，前列腺癌個體化和程序化治療管理的發(fā)展受到了阻礙。前列腺特異抗原(PSA)由于較低的特異性和精確性，對于預后的估計也難盡如人意。近年來隨著檢測技術的發(fā)展，以及對其相互的整合和延伸，涌現(xiàn)出一些更具價值的新方法[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)腫瘤細胞的檢測分析在mCRPC預后方面有一定的前瞻價值[3]，這為臨床腫瘤(包括前列腺癌)的治療和轉(zhuǎn)移機制的研究帶來深遠的影響。本文整理綜述有關外周血循環(huán)腫瘤細胞及其對前列腺癌預后判斷價值的研究，為去勢抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer，CRPC)的個體化治療方向提供參考。

1CTCs介紹

早在1869年Ashworth就研究發(fā)現(xiàn)在癌癥死亡患者的外周血液中可以提取到腫瘤類似細胞，并首次提出“循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)”的觀點。循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)是指由腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶自發(fā)或被動的脫落、轉(zhuǎn)移進入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細胞。在這些細胞中，大部分由于免疫清除及自身周期而很快死亡，但也有少數(shù)的細胞相互聚集生長成癌栓，并在相應組織中發(fā)展為轉(zhuǎn)移病灶。此外，在對腫瘤轉(zhuǎn)移的研究過程中發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞脫落→進入外周循環(huán)→侵襲生長已然成為轉(zhuǎn)移的關鍵步驟。所以，CTCs的檢測很可能是及時反映腫瘤轉(zhuǎn)移情況、判斷病情進展的可靠指標。

近年來，CTCs在分子生物學、臨床檢測及應用研究等方面發(fā)展迅速，相繼的科研文獻也表明了CTCs在胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌的臨床診治方面的價值。隨著檢測技術的發(fā)展，表面標記、分子分型等分析水平的提高，很有可能普及CTCs的應用以成為有效的腫瘤標志物[4-5]。

2CTCs的檢測及計數(shù)

2.1CTCs的檢測方法由于對CTCs富集檢測的障礙，使得CTCs的研究處于瓶頸。所以，近年來一大批檢測技術及方法層出不窮。例如：CTCs芯片，微流控成像細胞計數(shù)，酶聯(lián)免疫斑點法，多色活體流式細胞儀技術，Cellsearch系統(tǒng)等。上述這些最新的CTCs檢測方法、標志物各異，優(yōu)缺點也不盡相同。

目前，基于免疫磁性原理的富集技術——CellSearch系統(tǒng)，已被廣泛應用。此系統(tǒng)方法主要包括陽性富集和陰性富集：首先，Ep-CAM標記磁珠對上皮細胞進行富集，經(jīng)固定后，用4’，6-二脒基-2-苯基吲(DAPI)熒光染料、CD45抗體、胞內(nèi)角蛋白抗體(CK-PE)進行分選，最終把具有腫瘤細胞形態(tài)學特點且DAPI(+)、CD45(-)、CK(-)PE(+)的細胞判定為CTCs。早在幾年前，Aliard等[6]應用此技術對3組不同的人群(健康者、非惡性腫瘤患者、原發(fā)及轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤患者)檢測其外周血中的CTCs。結(jié)果表明，在所有被檢7.5 ml外周血液中，僅在惡性腫瘤患者中可富集分選出此細胞，且具有顯著性差異。但此方法亦有局限性，易遺漏發(fā)生上皮間質(zhì)變(EMT)的細胞，并具有較大的假陰性率。

基于相似的免疫原理，CTCs芯片是一種新穎的微流體控動力學的富集手段。其每一張硅片上均有包被Ep-CAM抗體的位點，可避免白細胞錯誤的結(jié)合干擾。當設定外周檢測血標本以特定速度通過芯片時，Ep-CAM陽性CTCs便被固定下來。通過對CK、DAPI陽性選擇和CD45陰性選擇處理，再經(jīng)顯微鏡便可對細胞定性[7]。然而，此方法尚未成熟，成本亦較高。

相比較免疫學原理，密度梯度離心法和膜濾過分離法便是基于形態(tài)學的分離集合方法。原理很簡單，即CTCs細胞密度普遍低于其他正常血細胞，而直徑則因為分化問題大于其他血細胞，所以可以通過物理方法富集。此方法簡單易行，價格成本低，但不可避免地是缺乏特異性，因腫瘤細胞變異較大，且密度直徑近似的血細胞可混雜干擾。

2.2CTCs計數(shù)在多樣的檢測中，CTCs計數(shù)可能較具有重要意義。早在之前，Danila等學者[4]在評估abiraterone治療CRPC的Ⅱ期實驗研究中，發(fā)現(xiàn)有34%和41%的患者在治療過程中，CTC計數(shù)由先較差狀態(tài)(CTC≥5個)過渡為有利狀態(tài)(CTC<5個)[5]。與此同時，另一項研究表明，CTC計數(shù)水平無明顯的固定界值，而僅僅作為預測患者生存率狀況的一個參考指標[8]。在臨床藥物阿比特龍的應用過程中，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，CTC計數(shù)結(jié)合LDH及其他組織標志物變化水平，對于患者生存相關性的分析要優(yōu)于單一前列腺特異性抗原(PSA)的變化[9]。這些發(fā)現(xiàn)強化了CTC計數(shù)可能成為一個潛在的替代性生物標記來反映治療效果和生存率。

3CTCs的表觀及標記物分析

除了CTCs細胞計數(shù)在臨床方面的應用，其分子檢測、表觀水平的分析也提高了其檢測準確性和臨床可信度。迄今為止，受CTCs分離富集技術的限制，CTCs甲基化表觀水平的研究非常稀缺。其中，甲基化作為一種重要的表觀修飾，參與諸多機制，影響了基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達等過程，影響著腫瘤的發(fā)展與遷移。例如，在胃癌中，p15缺失或突變十分少見，但由于其CpG島甲基化而導致其mRNA轉(zhuǎn)錄異常，這樣就導致該基因失活，從而成為胃癌形成的關鍵因素[10]。在一些先驅(qū)性研究中，Chimonidou等[11-13]研究了來自乳腺癌患者血清中腫瘤細胞相關癌基因的甲基化水平，選定的基因包括胱抑素B(CST6)、BRMS1、SOX-17等。結(jié)果顯示：CST6的表觀沉默[14-15]、BRMS1[16]、SOX-17甲基化[17-18]均可影響其表達轉(zhuǎn)錄，進而下調(diào)抑癌效果，縮短總體生存時間。而在前列腺癌方面的研究，F(xiàn)riedlander等[19]利用mCRPC患者血清腫瘤細胞侵襲的特性，在未化療前通過細胞黏附基質(zhì)富集CTCs。此技術黏附的細胞可隨后釋放在特定的環(huán)境中培養(yǎng)，以備精確的計數(shù)及分子研究。通過甲基化陣列覆蓋腫瘤細胞的27 000個CpG位點，研究者得出：來自mCRPC患者腫瘤細胞的平均甲基化水平高于良性前列腺組織。值得注意的是，他們早在之前對mCRPC患者組織1 361位點甲基化的實驗研究[20]中就發(fā)現(xiàn)，有86%的位點在這些侵襲性的細胞中同樣地甲基化，而且這些侵襲性腫瘤細胞的甲基化更多地出現(xiàn)在那些凋亡、血管生成相關的基因位點。這一探索性的全基因組分析預示著保留在CTCs一些表觀水平的分子機制和原發(fā)性腫瘤的進展是密切相關的。除了基于患者體外的研究證據(jù)，來自Ogunwobi等[21]建立的小鼠肝細胞癌模型的CTCs數(shù)據(jù)也表明：肝細胞生長因子及其受體(c-Met)基因的啟動子低甲基化，從而在CTCs中表現(xiàn)出相應基因產(chǎn)物的高表達。

當前，研究已不僅僅局限于表觀甲基化方面，其他標記物的檢測分析也逐漸開拓。早期臨床研究發(fā)現(xiàn)，一些核酸物質(zhì)，尤其是細胞游離DNA(cfDNA)在腫瘤患者血清中的濃度有所增高[22]，而且基因和表觀水平研究也證實了此點。但由于cfDNA起源混雜，無法精確，且難以追蹤到特定的腫瘤細胞群，所以逐漸淡化了其臨床應用的可能。迄今，CTCs的分子研究多聚焦于基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學。例如，不久前，Miyamoto等[23]便研究探索了CTCs中雄激素受體(AR)是否可以提供前列腺癌治療相關有效的信息。他們的前研究證實，AR作為核受體超家族轉(zhuǎn)錄因子之一，其信號通路的異常與前列腺癌的發(fā)生密切相關。此次研究采取免疫熒光法標記人前列腺癌細胞株(LNCaP)來判斷AR信號通路激活的程度，標記顯示PSA(+)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)(+)可定義為雄激素信號活躍。將該項標記應用于前列腺癌患者的CTCs,再通過免疫磁珠Ep-CAM富集技術可進行分析判斷。最終發(fā)現(xiàn)，對于去雄治療敏感的患者，其與AR信號通路的下調(diào)抑制有著很大聯(lián)系。與此同時，發(fā)展為去雄抵抗性的患者，如果其AR信號通路活躍，對abiraterone類雄激素合成抑制劑的治療反應較差。由此說明，此類藥物不能夠有效下調(diào)阻斷雄激素受體，并可導致耐藥及病情惡化[24]。所以，上述的這些初步研究結(jié)果均提示，CTCs系列的分子表型在臨床療效方面的監(jiān)測價值，但相應標記的選取及實施的規(guī)范化仍需進一步的證實和完善。

4CTCs在mCRPC方面的應用進展

對于早期前列腺癌，內(nèi)分泌治療有一定療效，但進展為激素非依賴性前列腺癌后的治療效果變差。正如前面所述的分子標記研究，CTCs與內(nèi)分泌治療之間的關系已早有關注。如有一項研究利用CellSearch標準方法檢測了80 例接受內(nèi)分泌治療的轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者外周血中的CTCs，結(jié)果表明，檢出的CTCs數(shù)目≥5個/7.5 ml，相應患者中位生存時間為17個月；而CTCs<5個/7.5 ml，其對應的中位生存時間在32個月以上 (P<0.007)，表明CTCs是內(nèi)分泌治療預測的敏感指標[25]。隨后有研究發(fā)現(xiàn)，CTCs計數(shù)在評估化療效果、復發(fā)可能大小、生存時間等方面均比PSA敏感且更具價值[26]，但與PSA水平變化無明顯相關性。目前，CTCs計數(shù)仍有一定限制，其特異性及普及性有待提高和完善。

最近，復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院Chang等[27]收集了70例mCRPC患者和20例健康人的外周血標本，利用CellSearch方法完成CTC的計數(shù)，利用Taqman探針的Realtime-PCR方法完成對CTC的干細胞標記物檢測?；谘芯?，上皮間充質(zhì)變(EMT)已經(jīng)共識為腫瘤細胞散布轉(zhuǎn)移的重要機制過程，且表現(xiàn)活躍于CTCs中。特此，在這些外周血樣中，研究人員檢測了干細胞相關基因(ABCG2，PROM1及PSCA)和EMT相關基因(TWIST1及vimentin)，而后記錄患者的總存活數(shù)(OS)及治療方法。結(jié)果，類似于CTCs計數(shù)，相關干細胞基因陽性表達預示mCRPC患者預后不良(P=0.01)。但是，EMT的基因表達卻無任何預后價值(P=0.78)。一項多元研究表明，血清白蛋白(P=0.04)、ECOG評分(P<0.01)、CTCs計數(shù)(P=0.02)、干細胞基因標記物檢測(P=0.01)均是獨立的預后判斷因子[28]。此外，盡管有40例歸類于良好CTCs計數(shù)的患者，但干細胞標記物檢測為陽性，均預后不良(P<0.01)。相比較單項CTCs計數(shù)指標，一項結(jié)合了計數(shù)和標記物檢測的預后模型則反映了預判價值的提高(一致性概率從0.716到0.889)。對于那些接受多西他賽聯(lián)合強的松第一治療的患者，干細胞標記物陽性患者往往無進展生存期(PFS)短。而聯(lián)合計數(shù)，EMT基因標記物檢測模型卻無PSA-PFS及PSA反應率的相關改變。綜上所述，干細胞標記物檢測聯(lián)合CTCs計數(shù)能大大提高CTCs的預后判斷價值，但尚有待進一步開發(fā)和完善。

5前景及展望

隨著近年研究的發(fā)展，CTCs計數(shù)作為前列腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌的預后評價指標[29-30]，以及CellSearchTMSystem在MBC患者生存時間預測的應用已被FDA批準。臨床數(shù)據(jù)表明，在趨勢抵抗性前列腺癌患者中，CTCs計數(shù)的增加，一般提示疾病的發(fā)展、轉(zhuǎn)移灶的增加及復發(fā)時間的縮短。但目前尚不能標準化為臨床治療判斷的標志，也尚未在臨床廣泛的驗證和普及。在這方面技術上是最大的限制，普通精度的儀器很難在數(shù)以億計的血細胞中發(fā)現(xiàn)為數(shù)不多的腫瘤細胞，并且將其與其他上皮來源的非腫瘤細胞區(qū)分開。技術上富集CTCs的障礙也使CTCs表觀甲基化水平的研究陷入瓶頸。目前，尚無純分離CTCs表觀甲基化研究文章的發(fā)表。希望將來通過技術的創(chuàng)新發(fā)展，在臨床治療前進行CTCs檢測或是標記物分析，建立有效參考值范圍，并在治療過程中監(jiān)測，實現(xiàn)個性化治療方案。從深層的角度對CTCs分選后進行分子生物學特性研究，尋找可靠的腫瘤分子靶標，建全檢測的分子標記譜，不僅可以提高CTCs檢測的特異性，也能預測腫瘤細胞分子模式，為腫瘤治療提供藥物靶標參考。除此之外，通過基因不同區(qū)段的測序，對比研究原發(fā)性腫瘤細胞與不同階段CTCs細胞基因水平的差異，可以確定腫瘤發(fā)生過程中是否有關鍵基因表達模式的改變?？偠灾?，不同水平研究CTCs，完善其預后判斷價值及其他生物學意義，體現(xiàn)了臨床工作及患者個體化治療的需要。

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基金項目：國家自然科學基金(81372757)；江蘇省高等學校大學生實踐創(chuàng)新訓練計劃項目(201510312009Z)

作者單位：210029江蘇南京，南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科(張傳杰，梁超，李普，秦超)；南京醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院(張傳杰，孫長策，許潔，陸怡超，曹雪琛，黃飛揚)

通訊作者：秦超，男，副主任醫(yī)師，研究方向：泌尿、男生殖系腫瘤，E-mail：qinchao@njmu.edu.cn

doi：10.3969/j.issn.1674-4136.2016.02.006

文章編號：1674-4136(2016)02-0091-05

[收稿日期：2016-04-05][本文編輯：李筱蕾]