夏 靜 牛長(zhǎng)敏 馬海濤 申雪沂 王建軍 綜述 鄭 英 審校

揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室（江蘇揚(yáng)州 225001）

mTOR信號(hào)通路在生精細(xì)胞發(fā)育中的作用

夏 靜 牛長(zhǎng)敏 馬海濤 申雪沂 王建軍 綜述 鄭 英 審校

揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室（江蘇揚(yáng)州 225001）

精子發(fā)生是指精原細(xì)胞經(jīng)過一系列分裂分化演變?yōu)榫拥倪^程,包括精原干細(xì)胞的增殖及其子細(xì)胞分化、精母細(xì)胞的減數(shù)分裂和精子形成三個(gè)階段。許多研究表明mTOR信號(hào)通路參與精子發(fā)生的各個(gè)階段。本文主要就mTOR信號(hào)通路在生精細(xì)胞發(fā)育的不同階段中的作用做一綜述。

一、mTOR信號(hào)通路

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）廣泛存在于各種生物細(xì)胞中，是細(xì)胞生長(zhǎng)的中心調(diào)控因子[1]。它存在兩個(gè)功能不同的復(fù)合物，mTORC1和mTORC2。其中mTORC1起主要作用，mTORC1包含mTOR、調(diào)節(jié)蛋白R(shí)aptor和其他結(jié)合蛋白，是抑制劑雷帕霉素的主要作用靶點(diǎn)，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和蛋白質(zhì)合成。mTOR主要受磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT/PKB）信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。mTOR通過對(duì)其下游翻譯相關(guān)蛋白：核糖體40s小亞基S6蛋白激酶（70-ku ribosomal protein S6 kinase，p70S6K）、真核細(xì)胞翻譯啟動(dòng)因子4E結(jié)合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein，4E-BP1）、真核細(xì)胞翻譯啟動(dòng)因子4B（eukaryotic translation initiation factor 4B，eIF-4B）以及核糖體蛋白S6（ribosomal protein S6，rPS6）的磷酸化而發(fā)揮調(diào)控作用。其中4E-BP1是翻譯的負(fù)調(diào)控子，它與基因mRNA 5’端帽狀結(jié)合蛋白eIF-4E結(jié)合并抑制其活性，阻止翻譯起始。當(dāng)上游某一信號(hào)刺激后，使mTOR磷酸化，磷酸化的mTOR使4E-BP1失活，導(dǎo)致4E-BP1與eIF-4E解離，游離的eIF-4E與eIF-4G、eIF-4B、eIF-4A結(jié)合形成eIF-4F起始復(fù)合物，結(jié)合到mRNA 5’末端的帽結(jié)構(gòu)上，促進(jìn)翻譯起始[2]。因此，mTOR活化的目的是使翻譯起始復(fù)合物形成，從而調(diào)控依賴性靶向mRNA的翻譯。

二、mTOR信號(hào)通路與精原細(xì)胞發(fā)育

精子發(fā)生始于SSCs，SSCs一部分自我更新（維持干細(xì)胞池），另一部分則分裂分化為Aal型精原細(xì)胞，Aal型精原細(xì)胞再分化為A1-A4、In及B型精原細(xì)胞。B型精原細(xì)胞演變成初級(jí)精母細(xì)胞，而mTOR可以通過多種信號(hào)通路來調(diào)控其增殖分化中相關(guān)基因的表達(dá)。

（一）mTOR在精原干細(xì)胞增殖中的作用

精原干細(xì)胞來源于原始生殖細(xì)胞，其依賴受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase, c-Kit）與干細(xì)胞因子（stem cell factor, SCF）相互作用而遷移至未分化性腺，啟動(dòng)其增殖分化。研究發(fā)現(xiàn)雄鼠突變體由于SCF/c-kit不能激活PI3K通路而導(dǎo)致精子發(fā)生缺陷，表現(xiàn)出精原干細(xì)胞增殖能力減弱及細(xì)胞異常凋亡[3]。Feng等證實(shí)了SCF/c-KIT通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)的活化使細(xì)胞周期蛋白D3表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)G1 期到S 期，從而加速細(xì)胞周期[4]。而這條通路對(duì)G1期的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白D1、CDK4、CDC25A 的合成均有抑制作用[4]。Busada等發(fā)現(xiàn)RA可通過PI3K/AKT/m TOR信號(hào)通路誘導(dǎo)精原細(xì)胞內(nèi)c-Kit蛋白的合成[5]。推測(cè)：在精子發(fā)生中，PI3K/AKT/m TOR信號(hào)通路可能與c-kit存在反饋調(diào)節(jié)。mTOR通過磷酸化激活下游信號(hào)分子p70S6K，促進(jìn)精原干細(xì)胞增殖分化中蛋白質(zhì)的合成，隨著年齡的增長(zhǎng)，mTOR蛋白表達(dá)下降且其對(duì)下游靶蛋白p70S6K的磷酸化能力下降，導(dǎo)致精子數(shù)量減少、生精小管空泡化增多[6]。以上研究表明，c-Kit與PI3K/ AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)有絲分裂增殖的調(diào)控是必不可少的。Huang等發(fā)現(xiàn)在大鼠睪丸內(nèi)，胰島素樣生長(zhǎng)因子受體1（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF -1R）-PI3K/AKT/mTOR/缺氧誘導(dǎo)因子2α（hypoxia inducible factor 2α，HIF-2α）信號(hào)通路調(diào)控著精原干細(xì)胞的增殖[7]。在培養(yǎng)的原始生殖細(xì)胞中，干擾IGF-1R表達(dá)或用PI3K抑制劑LY294002或雷帕霉素處理，均可有效抑制IGF-1R或八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（octamer-binding transcription factor 4, Oct-4）與HIF-2α的表達(dá)，使原始生殖細(xì)胞數(shù)量明顯減少[7]。Hobbs等發(fā)現(xiàn)在敲除早幼粒細(xì)胞白血病鋅指蛋白（promyelocytic leukemia zinc fnger, PLZF）的大鼠精原干細(xì)胞模型中，過度活化的mTORC1可抑制精原干細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial-derived neurotrophic factor，GDNF）的反應(yīng)并導(dǎo)致精原干細(xì)胞池中各型精原細(xì)胞數(shù)量顯著減少[8]。GDNF是精原干細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因子，其調(diào)控SSCs自我更新和分化平衡[9]。另外，PLZF可通過誘導(dǎo)mTORC1抑制劑活化來抑制發(fā)育及DNA損傷反應(yīng)調(diào)節(jié)基因1（regulated in development and DNA damageresponses 1, redd1）的表達(dá)[8]。

綜上所述， PI3K/AKT/m TOR與多種信號(hào)分子共同調(diào)控精原干細(xì)胞增殖分化，使其有序正常進(jìn)行。

（二）mTOR在精原細(xì)胞分化中的作用

從Aal型精原細(xì)胞依次分化形成 A1、A2、A3、A4、In、B型精原細(xì)胞，其過程即A型精原細(xì)胞分化，而mTORC1的活性對(duì)分化相關(guān)基因的翻譯是必須的。

Busada等研究用雷帕霉素檢測(cè)了mTORC1對(duì)小鼠精原細(xì)胞分化的影響，發(fā)現(xiàn)mTORC1活化對(duì)未分化精原細(xì)胞的維持是非必需的，而對(duì)精原細(xì)胞分化的啟動(dòng)是必不可少的[10]。眾所周知，RA對(duì)精原細(xì)胞分化起著重要調(diào)控作用，其中一條通路即是RA與其受體RARA結(jié)合作用于RAREs反應(yīng)元件上，再結(jié)合到PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85或催化亞基p110β后誘導(dǎo)ERK（細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶）及AKT的磷酸化，而mTOR有AKT磷酸化位點(diǎn)（Trh2446及Ser2448），使mTOR也被磷酸化，發(fā)揮激活下游蛋白功能[11]。在成年睪丸中雷帕霉素能使Stra8的表達(dá)降低，它是RA的一個(gè)直接調(diào)控靶基因，參與精原細(xì)胞分化[12]。同樣雷帕霉素也阻礙了分化相關(guān)基因Rhox13、Kit、Sohlh1、Sohlh2等mRNA的翻譯[10]。Rhox13（X-linked reproductive homeobox gene 13）是一個(gè)生殖同源框基因，在分化的精原細(xì)胞內(nèi)它應(yīng)答RA后表達(dá)上調(diào)，它的敲除將導(dǎo)致第一批生精波中生殖細(xì)胞凋亡、圓形精子出現(xiàn)的時(shí)間延遲[13]。精子發(fā)生與卵子發(fā)生特異性螺旋繞螺因子1（spermatogenesis and oogenesis specific basic helix-loop-helix 1, Sohlh1）、Sohlh2在分化的精原細(xì)胞中表達(dá)明顯增加，且Sohlh1、Sohlh2可以形成異二聚體，結(jié)合在Sohlh1基因上游的啟動(dòng)子序列SP1上，啟動(dòng)精原細(xì)胞分化，而兩者均可促進(jìn)Kit在精原細(xì)胞中表達(dá)[14]。出生7 d 小鼠睪丸內(nèi)Sohlh1 功能缺失會(huì)導(dǎo)致一系列基因表達(dá)變化，如在精原細(xì)胞分裂過程中起重要作用的 LIM同源基因 Lhx8 的表達(dá)降低，同時(shí)與精原細(xì)胞分化相關(guān)的一些基因如Kit、Ngn3和Crabp1的表達(dá)也會(huì)減少；Sohlh1 功能缺失的同時(shí)，睪丸也會(huì)表達(dá)一些特有的轉(zhuǎn)錄因子，如 Etv5、ERM、Taf-4b 和 PLZF，這些基因?qū)?xì)胞的增殖和分化有著重要的作用[15]。以上研究說明mTORC1信號(hào)通路的活化與否可以直接或間接影響分化相關(guān)基因的表達(dá)。另有研究發(fā)現(xiàn)RA也可通過與支持細(xì)胞表面受體KITL結(jié)合后激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，使分化基因Kit蛋白表達(dá)[5]。

綜上所述，精原細(xì)胞通過PI3K/AKT/mTORC1信號(hào)通路應(yīng)答視黃酸進(jìn)行分化時(shí)，是以轉(zhuǎn)錄活性形式及增加激酶信號(hào)雙重應(yīng)答的。

三、 mTOR對(duì)減數(shù)分裂細(xì)胞及其子細(xì)胞的作用

SSC經(jīng)過有絲分裂后分化為初級(jí)精母細(xì)胞，隨后進(jìn)入減數(shù)分裂形成圓形精子細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)：與圓形精子細(xì)胞相比，精母細(xì)胞表現(xiàn)出更高水平的蛋白合成，這是通過rPS6的磷酸化翻譯水平的增加來實(shí)現(xiàn)的，rPS6也是mTOR下游分子，翻譯的標(biāo)記物；磷酸化的rPS6在圓形精子細(xì)胞中是顯著降低的[16]，說明精母細(xì)胞及圓形精子細(xì)胞中翻譯的比例與rPS6磷酸化水平都是不同的。然而，在精子發(fā)生的后期rPS6磷酸化水平升高，與實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)出低蛋白合成率和mTOR表達(dá)水平顯著下降的結(jié)果不一致，這可能是由于p90RSK對(duì)rPS6磷酸化的調(diào)控所致[17]。p70S6K是mTOR下游的靶蛋白，它通過磷酸化核糖體S6蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)具有5’TOP的mRNAs,繼而調(diào)節(jié)數(shù)百種生物因子的轉(zhuǎn)錄。有研究發(fā)現(xiàn)在敲除p70S6K基因的果蠅細(xì)胞中，細(xì)胞周期延長(zhǎng)到正常的二倍，這說明p70S6K在細(xì)胞周期進(jìn)程中也有它的生理作用[18]。而在初級(jí)精母細(xì)胞中p70S6K有明顯表達(dá)，但胞核的著色明顯深于胞漿，而在精子中則無此趨勢(shì)[16]。精子形成以后精核高度濃縮，其轉(zhuǎn)錄與合成代謝水平低，精子合成p70S6K的可能性不大，這說明在生精過程中，p70S6K可能從胞核轉(zhuǎn)移到胞漿。而在晚期精子變形階段， rpS6磷酸化可能與mTOR的表達(dá)是解偶聯(lián)的。這也與此期EIF4F復(fù)合物裝配活性降低是一致的，這種復(fù)合物的形成通常是翻譯調(diào)控中受限的一步[19]。與粗線期精母細(xì)胞相比，EIF4G 在精子細(xì)胞中明顯上調(diào)，使得EIF4E與更多的 EIF4G 相互作用，從而抑制翻譯。以EIF4G 結(jié)合到5’帽端相互作用的（7-methyl-GTP）EIF4E 與它在細(xì)胞內(nèi)水平的比例來檢測(cè)EIF4F裝配的有效性，發(fā)現(xiàn)精母細(xì)胞表現(xiàn)出更高的裝配有效性[19]。因?yàn)镋IF4F裝配主要受mTOR活性的影響，且依賴于EIF4G 和EIF4EBP1對(duì)EIF4E的競(jìng)爭(zhēng)，而mTOR（及其靶蛋白EIF4EBP1）的表達(dá)從精原細(xì)胞到長(zhǎng)形精子是穩(wěn)定下降[20]。研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素處理后，將抑制精母細(xì)胞中mTOR及p70S6K的活性，但不抑制磷酸化的4EBP1的活性[21]。這篇研究也發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素會(huì)導(dǎo)致幾個(gè)精母細(xì)胞特異性miRNAs的表達(dá)發(fā)生改變，如：miR-15b, miR-18a, miR-34c,miR-425, miR-449a及miR-296-5p，尤其是使miR-15b, miR-18a, miR-425, miR-449a的表達(dá)水平顯著下調(diào)，而miR-375及 miR-34c 表達(dá)上調(diào)[20]。這些miRNA對(duì)其靶基因起著轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控作用，如miR-15b的靶基因Akt3，是PI3K信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，它的改變將使這條通路調(diào)控異常。由此說明，在正常生理狀態(tài)下，mTOR也是受相關(guān)miRNA的調(diào)控，從而影響減數(shù)分裂中相關(guān)基因的表達(dá)。有關(guān)這方面的認(rèn)識(shí)還需要進(jìn)一步探索。另外有研究發(fā)現(xiàn)，用雷帕霉素處理抑制mTOR信號(hào)后，將會(huì)使細(xì)線前期精母細(xì)胞中的p-p70S6K、p-4EBP1、PCNA、Stra8的表達(dá)顯著下降，從而影響減數(shù)分裂[22]；同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)mTOR、p-mTOR及p70S6K在生精小管不同階段的表達(dá)是不同的，在生精小管第Ⅶ-Ⅷ階段的細(xì)線前期精母細(xì)胞中，mTOR及p-mTOR顯著表達(dá)，p70S6K、p-p70S6K在細(xì)線期精母細(xì)胞中表達(dá)，而p-p70S6K在圓形精子細(xì)胞及管周肌樣細(xì)胞中也表達(dá)。以上研究表明，mTOR及其下游信號(hào)分子參與調(diào)控精母細(xì)胞減數(shù)分裂的過程。

Boyer等發(fā)現(xiàn)條件性敲除支持細(xì)胞內(nèi)mTOR基因后，隨著精子發(fā)生的進(jìn)程，成年小鼠睪丸表現(xiàn)出生精上皮的解體、支持細(xì)胞極性改變、生殖細(xì)胞凋亡增加、未成熟生殖細(xì)胞脫落、附睪內(nèi)精子數(shù)量減少及畸形精子數(shù)量增加，從而造成不育[23]。組織學(xué)分析及階段特異性標(biāo)記蛋白表達(dá)的定量分析發(fā)現(xiàn)，粗線期精母細(xì)胞及精子特異性丟失，而mTOR通過調(diào)節(jié)支持細(xì)胞內(nèi)緊密連接蛋白α1的分布來影響粗線期精母細(xì)胞的進(jìn)程[23]。

總之，mTOR信號(hào)通路的活性及與之相關(guān)的miRNA或相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)減數(shù)分裂細(xì)胞及其子細(xì)胞的正常發(fā)育是必須的。

結(jié)語與展望

關(guān)于mTOR作為一種對(duì)細(xì)胞增殖分化關(guān)鍵因子，在精子發(fā)生的各個(gè)階段發(fā)揮著重要作用。其抑制劑雷帕霉素作為治療器官移植后的排斥反應(yīng)在臨床上使用，關(guān)于其長(zhǎng)期使用后影響男性生殖健康的原因和機(jī)制目前雖然有所認(rèn)識(shí)，已有的結(jié)論與機(jī)制還不能完全詮釋它們?cè)诰影l(fā)生中的作用。因此，深入探究精子發(fā)生與mTOR信號(hào)通路之間的調(diào)控機(jī)制，將為男性生育能力的調(diào)控及生殖方面疾病的診斷和治療提供新的思路。

致謝：本文受國家自然科學(xué)基金（31371174）；揚(yáng)州市社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)計(jì)劃（2012127）基金項(xiàng)目資助

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白; 生精細(xì)胞;信號(hào)通路; 精子發(fā)生

1 Laplante M ,Sabatini DM. Cell 2012; 149(2):274-293

2 Hay N, Sonenbery N, Genes Dev 2004; 18(16): 1926-1945

3 Blume -Jensen P, Jiang G, Hyman R, et al. Nat Genet 2000; 24(2): 157-162

4 Feng LX, Ravindranath N, Dym M. J Biol Chem 2000; 275(33):25572-25576.

5 Busada JT, Chappell VA, Niedenberger BA, et al. Dev Biol 2015; 397(1): 140-149

6 許皓,陳雪梅,丁裕斌,等. 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào) 2012; 34(3): 218-225

7 Huang YH , Lin MH, Wang PC, et al. Mol Hum Reprod 2014; 20(6): 526-537

8 Hobbs RM, Seandel M, Falciatori I, et al. Cell 2010; 142(3): 468-479

9 Uchida A, Kishi K, Aiyama Y, et al. Biochem Biophys Res Commun 2016; 476(4): 546-552

10 Busada JT, Niedenberger BA, Velte EK. Dev Biol 2015; 407(1): 90-102

11 Lee SJ, Yang EK, Kim SG. Mol Pharmacol 2006; 70(1): 415-425

12 Sahin P, Sahin Z. Gungor-Ordueri NE, et al. Fertil Steril 2014; 102(5): 1482-1490

13 Busada JT, Velte EK, Serra N, et al. Reproduction 2016; 152(5): 379-388

14 Barrios F, Filipponi D, Campolo F, et al. J Cell Sci 2012; 125(Pt 6): 1455-1464

15 Zhang T, Murphy MW, Gearhart MD, et al. Dev Biol 2014; 141(19): 3662-3671

16 Messina V, Di Sauro A, Pedrotti S, et al. Biol Reprod 2010; 83(4): 607-615

17 Ogasawara R, Kobayashi K, Tsutaki A, et al. J Appl Physiol(1985) 2013; 114(7): 934-940

18 Thomas G. Biol Res 2002; 35(2): 305-313

19 Richter JD, Sonenberg N. Nature 2005; 433(7025): 477-480

20 Mader S, Lee H, Pause A, Sonenberg N. et al. Mol Cell Biol 1995; 15(9): 4990-4997

21 Mukherjee A, Koli S, Reddy KV. Andrology 2015; 3(5): 979-990

22 Sahin P, Sahin Z, Gungor-Ordueri NE, et al. Fertil Steril 2014; 102(5): 1482-1490

23 Boyer A, Girard M, Thimmanahalli DS, et al. Biol Reprod 2016; 95(1): 13

（2016-07-04收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.10.017

R 321.1