金緯緯 蔡平生 方軼萍 姚銳

多囊卵巢綜合征患者子宮內(nèi)膜HIF-1α表達及與子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)系

金緯緯 蔡平生 方軼萍 姚銳

目的觀察子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)因子α（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在多囊卵巢綜合征（PCOS）婦女子宮內(nèi)膜組織表達情況。方法PCOS引起的不孕不育患者40例為PCOS組，同期因男性因素或輸卵管因素就診的不孕癥患者40例為對照組，分別采用實時熒光定量PCR、蛋白印跡法（Western blot）檢測HIF-1α、VEGF基因和蛋白的相對表達量。結(jié)果與對照組比較，PCOS患者子宮內(nèi)膜組織HIF-1α、VEGFmRNA相對表達水平降低（0.45±0.041比1、0.65±0.053比1，P＜0.01）；PCOS組VEGF和HIF-1α蛋白表達也較對照組降低（0.085±0.053比0.25±0.015、0.036±0.021比0.096±0.032，P＜0.01）。結(jié)論PCOS患者子宮內(nèi)膜HIF-1α、VEGF表達降低。

多囊卵巢綜合征；子宮內(nèi)膜容受性；HIF-1α；VEGF

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是由神經(jīng)及激素調(diào)節(jié)紊亂引起的，以高雄激素血癥及慢性不排卵為特征的疾病。據(jù)統(tǒng)計有4%～12%生育年齡女性患有PCOS，是目前無排卵型不孕癥的最主要原因[1]。文獻報道，PCOS引起的不孕與子宮內(nèi)膜容受性密切相關(guān)[2]，而子宮內(nèi)膜血管生成及相關(guān)血管生成因子的表達與子宮內(nèi)膜容受性密切相關(guān)[3-4]。

低氧誘導因子家族（hypoxia-inducible factors，HIFs）是低氧誘導細胞產(chǎn)生的特異性蛋白家族，hypoxia-inducible factor-1（HIF-1）即I類低氧誘導因子是HIFs成員，是細胞應對低氧環(huán)境特異性表達的基因。低氧誘導因子HIF-1α是調(diào)控子宮內(nèi)膜血管生成的重要調(diào)控因子。因此，檢測PCOS患者子宮內(nèi)膜HIF-1α表達情況可反應子宮內(nèi)膜血管生成，可作為檢測子宮內(nèi)膜容受性重要指標。本研究觀察PCOS患者子宮內(nèi)膜HIF-1α、VEGF表達情況，探討PCOS患者子宮內(nèi)膜容受性改變引起的不孕之間的關(guān)系。

1 資料及方法

1.1 臨床資料選取2012年1月—2013年2月本院婦科門診就診多囊卵巢綜合征患者40例，符合2003年歐洲人類生殖和胚胎與美國生殖醫(yī)學會鹿特丹專家會議推薦標準：（1）稀發(fā)或無排卵；（2）高雄激素血癥或具有高雄激素的臨床表現(xiàn)；（3）B超顯示為多囊卵巢者（單側(cè)或雙側(cè)卵巢有＞12個直徑2～9mm的卵泡）；（4）凡具備以上3條中任意2條者，可診斷為多囊卵巢綜合征，并排除其他高雄激素血癥。40例患者均為已婚女性，年齡25～37歲，平均（31.5± 5.8）歲，不孕史3～7年，平均4.5年。同期因男性因素或輸卵管因素就診的不孕癥患者40例為對照組，年齡23～35歲，平均（32.5±5.4）歲。均為月經(jīng)周期正常；B超監(jiān)測有單卵泡成熟并排卵；基礎(chǔ)內(nèi)分泌檢查結(jié)果正常；婦科檢查及陰道B超未提示婦科器質(zhì)性病變存在；近3個月未用過激素類藥物。兩組患者年齡差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 主要試劑Trizol Reagent、QuantiTect SYBR Green PCR Kit購自Invitrogen公司；cDNA合成試劑盒購自Takara公司；anti-HIF-1α單克隆抗體購自美國CST公司；anti-VEGF單克隆抗體購自美國CST公司；羊抗兔二抗購于武漢博士德生物公司；RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 實驗方法

1.3.1 組織標本的提取PCOS組：40例PCOS患者均應用促排卵治療，月經(jīng)第12天開始陰道B超隔天監(jiān)測卵泡發(fā)育直至成熟卵泡排出，確定排卵日，促排卵治療方案包括：克羅米芬（CC）方案：CC 1天50～100mg，月經(jīng)第5天開始，連續(xù)使用5天，月經(jīng)第12天開始隔天B超監(jiān)測卵泡，至卵泡直徑18～20mm時，應用HCG。對照組：采用自然周期陰道B超監(jiān)測排卵。經(jīng)患者知情同意，經(jīng)B超隔天監(jiān)測排卵，并確認排卵后，排卵后5～7天經(jīng)嚴格消毒以小號刮匙于子宮前壁刮取內(nèi)膜組織約50mg，新鮮組織以凍存管分裝后立即置入液氮罐中，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。

1.3.2 實時熒光定量PCR檢測子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)因子（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA采用液氮研磨法將組織磨成粉末，加入Trizol（Invitrogen）混合，按Trizol說明書抽提總RNA。利用在線Primer 3.0軟件設(shè)計引物，GC含量40%～60%，產(chǎn)物大小89～203bp，再用Oligo 6.0軟件評估。引物均跨內(nèi)含子以減少基因組DNA的干擾，由Invitrogen公司合成。引物序列：HIF-1α：forward primer，TCACCACAGGACAGTACAGGATGC；reverse primer，CCAGCAAAGTTAAAGCATCAGGTTCC。VEGF：forward primer，ACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATG；reverseprimer，TTCTGTATCAGTCTTTCCTGGTGAG。 β-actin（β肌動蛋白）：forward primer，TCATGAAGT GTGACGTTGACATCCGT；reverse primer，CCTAGAAG CATTTGCGGTGCACGATG。反應在25μL的體系中進行，其中2×QuantiTect SYBR Green PCR 12.5μL、10μM的上下游引物各1μL、樣本cDNA 2μL（300ng）、RNA酶滅活水8.5μL。熱循環(huán)如下：94℃、5min；94℃、30s，57℃、30s，72℃、60s，40個循環(huán)；72℃、10min。

1.3.3 Western blot組織細胞全蛋白提取用RIPA蛋白裂解液，置于冰上裂解30min，中間需反復振蕩蛋白裂解液，然后用BIO-RAD凝膠電泳系統(tǒng)，8% SDS-PAGE膠，電泳，恒壓100V，90min；轉(zhuǎn)膜，NC膜，恒壓100V，90min。用TBST配置的5%脫脂牛奶室溫封閉1h，然后用TBST配置的2%BSA按相應濃度稀釋抗體，4℃輕搖孵育抗體過夜。第二天，回收一抗，TBST室溫洗膜10min，2次；用TBST配制的2% BSA按照1：5000稀釋二抗，NC膜室溫孵育二抗1h，然后TBST洗膜10min，2次。曝光過程由LANI2300曝光機完成。

1.4 統(tǒng)計學方法應用SPSS17.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（） 表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 PCOS患者子宮內(nèi)膜組織VEGF和HIF-1α mRNA的表達目的基因mRNA相對表達量用以下公式計算：folds=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參照基因）樣品組/（Ct目的基因-Ct內(nèi)參照基因）對照組[5]，得出VEGF和HIF-1α相對表達量即folds值。結(jié)果顯示，VEGF和HIF-1α相對表達量平均值分別為0.45±0.041和0.65±0.053，對照組VEGF和HIF-1α相對表達量均為1，統(tǒng)計學分析顯示PCOS組VEGF和HIF-1α mRNA相對表達量明顯低于對照組內(nèi)膜組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖1（封二）。

2.2 PCOS組患者子宮內(nèi)膜組織VEGF和HIF-1α蛋白的表達以β-actin作為內(nèi)參蛋白，PCOS組VEGF和HIF-1α蛋白表達分別為0.085±0.053和0.036±0.021，而對照組為0.25±0.015和0.096± 0.032，PCOS組中VEGF與HIF-1α蛋白表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖2（封二）。

3 討論

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是目前無排卵型不孕癥的最主要原因。既往研究[6]多關(guān)注的是PCOS與肥胖、糖尿病、胰島素耐受等代謝性疾病的關(guān)系。近年子宮內(nèi)膜容受性的研究已成為PCOS不孕癥的研究熱點問題。子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜對于胚胎的接受程度，至今已發(fā)現(xiàn)多種因素與其相關(guān)，如細胞間黏附因子（整合素、選擇素等）[7]、孕激素[8]、性激素及細胞生長因子（白介素、轉(zhuǎn)化生長因子等）[9-12]。而子宮內(nèi)膜血管生成及相關(guān)血管生成因子的表達與子宮內(nèi)膜容受性密切相關(guān)[3-4]。在子宮內(nèi)膜血管生成信號通路中，低氧誘導因子對血管生成及血管生成相關(guān)基因表達具有顯著的調(diào)控作用[4]。

VEGF是一類血管生成因子，具有誘導血管內(nèi)皮細胞增殖分裂，促使新生血管形成的作用。既往研究表明[13]在子宮內(nèi)膜癌及子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜組織中VEGF特異性高表達，VEGF特異性高表達可顯著增加子宮內(nèi)膜血供，提供腫瘤及子宮內(nèi)膜異常增生所需的大量營養(yǎng)物質(zhì)，而在PCOS患者子宮內(nèi)膜組織中，VEGF出現(xiàn)特異性低表達，且VEGF特異性低表達與PCOS患者子宮內(nèi)膜容受性及PCOS患者不孕密切相關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者子宮內(nèi)膜組織中VEGF呈現(xiàn)特異性低表達，與既往研究符合。

低氧誘導因子家族（hypoxia-inducible factors，HIFs）是低氧誘導細胞產(chǎn)生的特異性蛋白家族，編碼一類轉(zhuǎn)錄激活因子，參與細胞應對低氧多種生理生化過程，調(diào)控特異性基因的表達過程。研究顯示，HIF-1α在人體組織新生血管形成過程中發(fā)揮重要作用。HIF-1α是調(diào)控子宮內(nèi)膜血管生成的重要調(diào)控因子，可直接調(diào)控VEGF的表達。既往報道指出[15]，在肝癌細胞中，由于腫瘤細胞特殊代謝通路及腫瘤細胞特殊微環(huán)境，誘導激活HIF-1α的表達并進入細胞核內(nèi)，HIF-1α與PCG家族蛋白Cbx4結(jié)合（一類E3泛素連接酶）形成轉(zhuǎn)錄復合體，從而啟動VEGF的轉(zhuǎn)錄，誘導VEGF表達，加速肝癌組織血管生成過程，刺激肝癌細胞分裂增殖；而在骨肉瘤細胞中[16]，利用HIF-1α特異性siRNA敲除HIF-1α基因，VEGF在mRNA水平顯著下調(diào)。本研究檢測的HIF-1α在低氧環(huán)境中特異性高表達，在正常氧壓環(huán)境中，HIF-1α羥基化，但是在低氧條件下，由于HIF-1α羥基化介導的降解通路被阻斷，HIF-1α基因在細胞核內(nèi)累積，細胞產(chǎn)生一系列HIF-1α依賴的應對低氧的生理生化反應。在血管生成信號通路中，HIF可通過激活PI3K/AKT、MEK等通路調(diào)控血管生成細胞的增殖、遷移，調(diào)節(jié)血管內(nèi)滲透壓及血管生成趨向性[17]。

綜上所述，PCOS不孕不育患者子宮內(nèi)膜HIF-1α和VEGF表達都出現(xiàn)顯著下調(diào)，結(jié)合既往研究，我們目前考慮PCOS不孕不育患者子宮內(nèi)膜中HIF-1α可調(diào)控VEGF的表達，HIF-1α和VEGF表達下調(diào)導致患者子宮內(nèi)膜血管生成受阻，從而影響內(nèi)膜容受性及胚胎著床過程，造成PCOS患者不孕不育。但是PCOS不孕不育患者子宮內(nèi)膜HIF-1α調(diào)控VEGF的具體過程，還需后續(xù)試驗驗證。

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（收稿：2015-10-17修回：2016-03-11）

Expression of HIF-1in Polycystic Ovary Syndrome Patients and Its Relationship with Endometrial Receptivity

JIN Weiwei,CAI Pingsheng,FANG Yiping,YAO Rui.Department of Obstetrics and Gynecology,WenzhouHospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Wenzhou(325000),China

ObjectiveTo determine the level of of hypoxia-inducible factor-1（HIF-1）and vascular endothelial growth factor（VEGF）in endometrium from polycystic ovary syndrome（PCOS）patients.MethodsForty women with PCOS-induced sterility and another 40 women with infertility due to male factor or fallopian tube factor were enrolled in this study.The relative expressions of HIF-1 and VEGF mRNA and protein in endometrial tissues from two groups were detected by real-time quantitative PCR and Western blot,respectively.ResultsThe expressions of HIF-1 and VEGF mRNA in PCOS patients were significantly higher than that in the other group（HIF-1：0.45± 0.041 vs 1;VEGF：0.65±0.053 vs 1;all P＜0.01）;the expressions of proteins were in the same pattern（HIF-1：0.085±0.053 vs 0.25±0.015;VEGF：0.036±0.021 vs 0.096±0.032;all P＜0.01）.ConclusionThe expressions of HIF-1and VEGF in PCOS women are declined.

polycystic ovary syndrome;endometrial receptivity;HIF-1;VEGF

浙江省溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科（溫州325000）

蔡平生，Tel：13757890261；E-mail：462080386@qq.com