劉海霞蔣業(yè)坤蔣漢茂曾之耀甘小艷徐軍發(fā)

關(guān)于B 7-H 5/CD 28 H信號(hào)途徑在結(jié)直腸癌中的表達(dá)以及對抗腫瘤免疫的影響分析

劉海霞1蔣業(yè)坤1蔣漢茂1曾之耀1甘小艷1徐軍發(fā)2

【摘要】目的 通過檢測B 7-H 5在不同分期的結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)差異，研究B 7-H 5與腫瘤分期的關(guān)系，并通過比較腫瘤浸潤細(xì)胞對不同表達(dá)程度的腫瘤細(xì)胞的殺傷試驗(yàn)，探索B 7-H 5在抗腫瘤免疫中的作用。方法 納入健康志愿者、T1～T4期結(jié)直腸癌患者各20例，比較其外周血及組織中B 7-H 5的表達(dá)情況；提取組織中的腫瘤浸潤細(xì)胞，在體外進(jìn)行擴(kuò)增，檢測其對不同B 7-H 5表達(dá)水平腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。結(jié)果 健康人外周血中無B 7-H 5，腫瘤分級(jí)越高，血液及組織中B 7-H 5的表達(dá)越高，提示B 7-H 5可以作為腫瘤嚴(yán)重程度的潛在指標(biāo)。腫瘤浸潤細(xì)胞殺傷試驗(yàn)表明，B 7-H 5是腫瘤殺傷的抑制因素。結(jié)論 血液及組織中B 7–H 5的表達(dá)含量可作為腫瘤分期及腫瘤免疫治療療效預(yù)測的潛在指標(biāo)，但因本試驗(yàn)樣本量較小，仍需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

【關(guān)鍵字】結(jié)直腸癌；B 7-H 5；腫瘤浸潤細(xì)胞

B 7-H 5，又名VISTA、Gi 24或Dies1，是最新鑒定的B 7共刺激分子家族的成員[1]。研究表明[2]，B 7-H 5在成熟的髓系抗原提呈細(xì)胞中高表達(dá)，而在活化的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中低表達(dá)。B 7-H 5主要通過CD-28 H受體信號(hào)途徑進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在適應(yīng)性免疫中發(fā)揮著重要的作用。本項(xiàng)目組前期研究結(jié)果顯示B 7-H 5 mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)低于正常人結(jié)直腸組織。本項(xiàng)目擬檢測B 7-H 5在不同健康志愿者中，分析結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，其表達(dá)量與分期的關(guān)系。同時(shí)對組織中的腫瘤浸潤細(xì)胞進(jìn)行體外分離擴(kuò)增，細(xì)胞腫瘤殺傷試驗(yàn)，探索B 7-H 5信號(hào)通路對抗腫瘤免疫的影響。

1　資料與方法

1.1 B 7-H 5在結(jié)健康人及結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)

1.1.1 實(shí)驗(yàn)分組 本次實(shí)驗(yàn)分為健康志愿者組及結(jié)直腸癌患者組。健康志愿者入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡40～65歲，男女各半。（2）未患有腫瘤，血、尿、便常規(guī)檢查正常。（3）志愿簽署知情同意書。結(jié)直腸癌患者入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡40～65歲，男女各半。（2）經(jīng)病理檢查確診為結(jié)腸癌或直腸癌。（3）腫瘤TNM病理分期為T1～T4期，每期各20例，男女各半。最終共入組健康志愿者20例，平均年齡（55.2±12.1）歲，男性10例，女性10例；結(jié)直腸癌患者組根據(jù)TNM分期進(jìn)行分組，T1、T2、T3、T4期患者各納入20例，T1組平均年齡（54.1±12.4）歲，T2組平均年齡（57.1±12.9）歲，T3組平均年齡（51.6±13.4）歲，T4組年齡（59.3±14.1）歲，每組男性10例，女性10例。

1.1.2 樣本收集 （1）血液樣本：健康志愿者于早晨空腹抽取靜脈血10 ml，肝素抗凝；結(jié)直腸癌患者于手術(shù)前和手術(shù)后一周空腹抽靜脈血10 ml，肝素抗凝，分離血漿放-80℃冰箱中保存，血細(xì)胞分離單個(gè)核細(xì)胞份兩份，一份置1 ml Trizol試劑中并于-80℃冰箱中保存，另一份細(xì)胞保存液中置液氮中保存。（2）組織樣本：手術(shù)中收集腫瘤患者正常腸組織、腸癌組織和癌旁組織，將組織塊分成4份，其中一份放液氮中保存、一塊置福爾馬林中保存、一份放1 ml Trizol試劑中并于-80℃冰箱中保存，第4份提取單個(gè)核細(xì)胞。

1.1.3 指標(biāo)檢測 （1）采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測健康志愿者及患者的外周血標(biāo)本中B 7-H 5的含量。（2）采用免疫組化法對組織樣本進(jìn)行檢測，檢測結(jié)直腸正常組織、結(jié)直腸癌組織中B 7-H 5的表達(dá)情況，組化結(jié)果分為4級(jí)，1級(jí)為陰性，2級(jí)為1%～30%的細(xì)胞染色，3級(jí)為31%～60%的細(xì)胞染色，4級(jí)為超過60%的細(xì)胞染色。

1.2 B 7-H 5/CD 28 H信號(hào)途徑對抗腫瘤免疫的影響

1.2.1 腫瘤細(xì)胞及腫瘤浸潤細(xì)胞的制備 （1）B 7-H 5（+）腫瘤細(xì)胞：直接分離B 7-H 5（+）的腫瘤細(xì)胞。（2）B 7-H 5（-）腫瘤細(xì)胞：采用B 7-H 5 shRNA慢病毒載體感染腫瘤細(xì)胞，沉默腫瘤細(xì)胞B 7-H 5的表達(dá)。（3）B 7-H 5（++）過表達(dá)腫瘤細(xì)胞：采用B 7-H 5慢病毒表達(dá)載體感染腫瘤細(xì)胞，作為B 7-H 5過表達(dá)組。（4）腫瘤浸潤細(xì)胞TILs：從癌組織中直接分離TILs，在體外用高劑量IL-2體外培養(yǎng)達(dá)到擴(kuò)增的目的。

1.2.2 體外抗腫瘤效應(yīng)試驗(yàn) 采用LDH釋放法檢測TILs對上述制備的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷試驗(yàn)，檢測TILs的抗腫瘤效應(yīng)，進(jìn)行殺傷試驗(yàn)的分組。見表1。

表1　 LDH釋放法腫瘤殺傷試驗(yàn)分組

表2 術(shù)前血液中B 7-H 5含量與腫瘤分期的關(guān)系

表3　 術(shù)后血液中B 7-H 5含量與腫瘤分期的關(guān)系

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對于連續(xù)型變量指標(biāo)，如果滿足正態(tài)分布且組間方差齊性檢驗(yàn)合格則采用方差分析進(jìn)行比較，如不滿足則采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較；對于率的指標(biāo)采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，手術(shù)前及手術(shù)后，健康志愿者血液中的可溶性B 7-H 5含量與及各級(jí)腫瘤患者均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表3、表4。

3　討論

近年來，腫瘤的發(fā)病率逐漸增高，尤其是惡性腫瘤，已成為危害人類健康的主要疾病之一[3]。細(xì)胞免疫在抗腫瘤免疫中起決定性作用，研究發(fā)現(xiàn)[4]腫瘤患者細(xì)胞免疫功能低下，可能是腫瘤免疫逃逸的重要原因。探討腫瘤逃逸、機(jī)體抗腫瘤細(xì)胞免疫作用的機(jī)制不僅對闡明腫瘤免疫的基本原理具有重要意義，也將為腫瘤免疫治療提供理論依據(jù)。機(jī)體腫瘤免疫主要是由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，其通過對腫瘤特異性抗原進(jìn)行識(shí)別，活化T細(xì)胞，產(chǎn)生腫瘤特異性效應(yīng)T細(xì)胞[5]，進(jìn)而發(fā)揮其特異性的免疫殺傷作用。初始T細(xì)胞活化的雙信號(hào)學(xué)說已獲公認(rèn)，該學(xué)說認(rèn)為初始T細(xì)胞活化需要兩個(gè)信號(hào)共同參與，即T細(xì)胞受體（TCR）與抗原肽-MHC復(fù)合物特異性結(jié)合的第一信號(hào)，APCs表面的B 7家族或其它共信號(hào)分子與其受體結(jié)合的第二信號(hào)。當(dāng)?shù)诙盘?hào)缺乏時(shí)，T細(xì)胞識(shí)別抗原后將不能有效增殖，導(dǎo)致免疫無應(yīng)答，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。

綜上所述，B 7-H 5分子的表達(dá)與結(jié)直腸癌腫瘤惡性程度具有一定的相關(guān)性，這使得B 7-H 5有可能作為結(jié)直腸癌惡性程度及預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)之一。

參考文獻(xiàn)

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[5] Zhu Y, Yao S, Iliopoulou BP, et al. B7-H5 costimulates human T cells via CD28H[J]. Nat Commun，2013（4）：2043.

作者單位：1 425000湖南省永州市中心醫(yī)院；2 523808東莞，廣東醫(yī)學(xué)院

Analysis Effect of B 7-H 5/CD 28 H Signal Pathway Expression in Colorectal Cancer and Antitumor Immune

LIU Haixia1JIANG Yekun1JIANG Hanmao1ZENG Zhiyao1GAN Xiaoyan1XU Junfa21 Yongzhou Central Hospital in Hu’nan Province, Yongzhou 425000, China. 2 Guangdong Medical College, Dongguan 523808, China

[Abstract]Objective Through the detection of B 7-H 5 expression differences in different stages of colorectal cancer tissue, study the B 7-H 5 and the relationship between the tumor stage, and by compare the tumor infiltrating cells destruction test on different expression level of tumor cells, explore the B 7–H 5 role in antitumor immunity. Methods In healthy volunteers, T 1-T 4 and 20 patients with colorectal cancer, compare the B 7–H 5 expression in peripheral blood and tissue, Extract the tumor infiltration in the tissue cells, in vitro amplification, detection of the expression level of different B 7–H 5 tumor cell killing activity. Results Healthy people without B 7–H 5 in peripheral blood, the higher the tumor grade, blood and tissue in the higher expression of B 7–H 5, prompt B 7–H 5 can be used as potential index of the extent of tumor. Tumor infiltrating cells selectively. the test showed that B 7–H 5 was tumor inhibitory factors. Conclusion The expression of B 7–H 5 content in blood and tissue can be use as a tumor stage and tumor immunotherapy effect forecast potential index, but because of the test sample size is lesser, still needs further validation.

[Key words]Colorectal cancer, B 7–H 5, Tumor infiltrating cells

基金項(xiàng)目：湖南省衛(wèi)生廳科研基金課題申請書（課題號(hào)：B2014-179）課題名稱（B7-H5/CD28H信號(hào)途徑在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其對抗腫瘤免疫的影響）

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.23.032

【文章編號(hào)】1674-9308（2015）23-0046-02

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B

【中圖分類號(hào)】R735.3+7