張麗君，劉龍龍，暢志堅(jiān)，郭彬，崔林*

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所,農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原 030031； 2.山西省

農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所,山西 太原 030031；3.山西省晉中市壽陽縣鄉(xiāng)鎮(zhèn)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管站,山西 壽陽 045400)

燕麥隱性核不育cSSR標(biāo)記的開發(fā)及其驗(yàn)證

張麗君1，劉龍龍1，暢志堅(jiān)2，郭彬3，崔林1*

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所,農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原 030031； 2.山西省

農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所,山西 太原 030031；3.山西省晉中市壽陽縣鄉(xiāng)鎮(zhèn)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管站,山西 壽陽 045400)

摘要：構(gòu)建燕麥隱性核不育轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，開發(fā)cSSR標(biāo)記，豐富燕麥分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫，并對(duì)隱性核不育相關(guān)cSSR標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，為充分利用燕麥種質(zhì)資源及深入研究隱性核不育奠定基礎(chǔ)。對(duì)燕麥雄性不育近等基因系CAMS1進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，利用軟件對(duì)得到的EST序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)查找和分析，開發(fā)cSSR 引物。并用CAMS1×品燕2號(hào)F2代群體對(duì)所開發(fā)的雄性不育相關(guān)的cSSR引物進(jìn)行驗(yàn)證。通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得的EST序列中6409條存在SSR位點(diǎn)，736條序列中有2個(gè)及2個(gè)以上SSR位點(diǎn)；在所有SSR位點(diǎn)中三核苷酸、二核苷酸重復(fù)序列最多，分別為4340(56.66%)和1768(24.30%)個(gè)。三核苷酸重復(fù)中，CCG/CGG(26.68%)、AGG/CTT(21.29%)、AGC/CTG(18.48%)出現(xiàn)的頻率較多，二核苷酸重復(fù)中，以AG/CT(60.63%)和AC/GT(26.24%)出現(xiàn)的頻率較高；根據(jù)開發(fā)的cSSR設(shè)計(jì)了13344對(duì)cSSR引物，選擇與雄性不育相關(guān)且能設(shè)計(jì)引物的21條序列合成45對(duì)SSR引物。PCR檢測表明，32對(duì)引物(71%)有擴(kuò)增產(chǎn)物，其中11對(duì)cSSR引物在親本間的擴(kuò)增產(chǎn)物具有多態(tài)性，7對(duì)引物在可育和不育性狀池間存在差異。本研究對(duì)燕麥雄性不育近等基因系CAMS1進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，根據(jù)得到的EST序列開發(fā)了13344對(duì)cSSR 引物，并利用CAMS1×品燕2號(hào)F2代群體進(jìn)行有效性檢測，32對(duì)引物有擴(kuò)增產(chǎn)物，7個(gè)標(biāo)記可用于燕麥雄性不育材料的分子檢測。

關(guān)鍵詞：燕麥；cSSR；SSR標(biāo)記

DOI：10.11686/cyxb2014232

Zhang L J, Liu L L, Chang Z J, Guo B, Cui L. Development and functional verification of cSSR markers for recessive genetic male sterility in oats. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(7): 146-154.

張麗君，劉龍龍，暢志堅(jiān)，郭彬，崔林. 燕麥隱性核不育cSSR標(biāo)記的開發(fā)及其驗(yàn)證. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(7): 146-154.

http://cyxb.lzu.edu.cn

收稿日期：2014-05-08；改回日期：2015-01-07

基金項(xiàng)目：山西省農(nóng)科院博士基金項(xiàng)目(YBSJJ209)，山西省自然基金項(xiàng)目(2014011030-1)，山西省國際合作項(xiàng)目(2014081032-1)和國家燕麥?zhǔn)w麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-08-A-1)項(xiàng)目資助。

作者簡介：張麗君(1981-)，女，河北行唐人，助理研究員，博士。E-mail:lijun.zhang911@163.com

通訊作者*Corresponding author. E-mail: sxcuilin@163.com

Abstract:The objective of this study was to develop new cSSR markers from an oat (Anena sativa) recessive genes male sterile transcriptome database. EST sequences obtained from a RNA-Seq of oat male sterile near-isogenic line CAMS9 were used to search for SSRs using software. cSSR primers were developed and functional verification for those related to male sterility was determined with a F2population of hybridized CAMS9 and Pinyan 2.6409 EST sequences obtained from the transcriptome sequencing had SSR loci and 736 of these sequences had 2 or more loci. Most of the sequence motifs were dinucleotides (56.66%) and trinucleotides (24.30%). For trinucleotides, CCG/CGG (26.68%), AGG/CTT (21.29%), AGC/CTG (18.48%), AAG/CTT (8.18%) and ACC/GGT (8.11%) were the most frequent repeats. For dinucleotides, AG/CT (60.63%) and AC/GT (26.24%) were the most frequent. Based on these cSSRs, 13344 pairs of cSSR primers were designed. 45 pairs of the primers were synthesized based on male sterile-related cSSRs, and 32 (71.1%) of the pairs led to amplified products. Using the F2population, the polymorphism of 11 pairs between parents and the differences of 7 pairs between fertile and sterile trait pools were detected. In total, 13344 pairs of cSSR primers have been developed from the RNA-Seq database. 32 pairs were related to fertility and 7 can be used for molecular detection of oat male sterility. These new cSSR markers are beneficial for the further use of oat germplasm and for the study of male sterility.

Development and functional verification of cSSR markers for recessive genetic male sterility in oats

ZHANG Li-Jun1, LIU Long-Long1, CHANG Zhi-Jian2, GUO Bin3， CUI Lin1*

1.CropGermplasmResourcesResearchInstitute,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences;KeyLaboratoryofCropGeneResourcesandGermplasmEnhancementonLoessPlateau,MinistryofAgriculture,Taiyuan030031,China; 2.InstituteofCropScience,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,Taiyuan030031,China； 3.QualityandSafetySupervisionofTownshipAgriculturalStation，Shouyang045400，China

Key words: oat (Avenasativa); cSSR; SSR

燕麥(Avenasativa)為禾本科燕麥屬(Avena)單子葉植物，具有降低血清膽固醇、甘油三脂和血糖的功效，是國際適銷的營養(yǎng)和醫(yī)用保健食品[1-3]。雄性不育既是研究植物生殖生物學(xué)重要的植物學(xué)性狀，也是研究作物雜種優(yōu)勢(shì)利用的重要農(nóng)藝性狀，因此在遺傳和分子生物學(xué)中具有重要地位。目前我國發(fā)現(xiàn)了兩種燕麥不育類型：皮燕麥隱性核不育[4]和裸燕麥顯性核不育[5]。

燕麥雄性不育材料不僅是寶貴的種質(zhì)資源，而且對(duì)改進(jìn)育種方法、提高育種效率具有非常重要的作用。但目前燕麥雄性不育植株的鑒別只能在抽穗后進(jìn)行。通過對(duì)燕麥雄性不育相關(guān)分子標(biāo)記的研究，促使不育植株的鑒別工作在苗期提前進(jìn)行，有利于雜交種子的大量獲得，對(duì)于更為有效地實(shí)現(xiàn)燕麥輪回選擇育種具有重要的應(yīng)用前景。

目前SSR(simple sequence repeats, SSR)、AFLP(amplified fragments length polymorphism, AFLP)、RFLP(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、RAPD(polymerase chain reaction, RAPD)和DarT(dynamic advertising reporting targeting, DarT)等分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于基因組分析[6]、遺傳多樣性分析[7]、分子育種[8]等方面，其中SSR分子標(biāo)記因具有共顯性遺傳、多態(tài)性高、多等位性以及技術(shù)簡單等優(yōu)點(diǎn)[9]而應(yīng)用最廣。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，cSSR標(biāo)記除保留了SSR標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)外，還具有其他的應(yīng)用特點(diǎn)：針對(duì)性強(qiáng)，若發(fā)現(xiàn)某個(gè)cSSR在某一性狀連鎖的基因或EST序列上，則該cSSR 就可能與此性狀相關(guān)；通用性好，由于EST 來自轉(zhuǎn)錄區(qū)，其保守性較高，具有較好的通用性，因而在親緣物種之間校正基因組連鎖圖譜方面及在比較作圖方面均有很高的利用價(jià)值[10]。現(xiàn)在cSSR標(biāo)記已在小麥(Triticumaestivum)[11]、大麥(Hordeumvulgare)[12]、水稻(Oryzasativa)[13]、高粱(Sorghumvulgare)[14]等物種中應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、品種鑒定、基因診斷等多種方面。

本研究利用Illumina HiSeqTM2000二代測序技術(shù)對(duì)皮燕麥隱性核不育植株的近等基因系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，分析了燕麥基因組中基因轉(zhuǎn)錄本所含微衛(wèi)星重復(fù)序列的組成和特征，后基于EST開發(fā)cSSR引物，并對(duì)其中的隱性核不育cSSR標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)掘可用于苗期鑒別燕麥雄性不育株與可育株的分子標(biāo)記，為燕麥育性研究以及育種方法的改進(jìn)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

燕麥雄性不育近等基因系CAMS1用于轉(zhuǎn)錄組測序；親本CAMS1和品燕2號(hào)，及其F2、F2:3群體用于對(duì)隱性核不育SSR標(biāo)記的驗(yàn)證。上述材料均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所提供。

1.2　轉(zhuǎn)錄組測序文庫構(gòu)建及測序

2011年冬天將燕麥雄性不育近等基因系CAMS1在溫室種植，室溫20℃左右，相對(duì)濕度(65±20)%，光照12 h/d，光強(qiáng)4000 lx。當(dāng)可育和不育植株在抽穗0~5 cm時(shí)，選擇不同發(fā)育階段雄蕊混合提取總RNA。用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用random hexamers合成第1條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第2條cDNA鏈，在經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)、加A并連接測序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建好的測序文庫用Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行測序。

1.3　SSR的開發(fā)

利用Illumina HiSeqTM2000對(duì)供試材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，將獲得的序列應(yīng)用MISA(MicroSAtellite)和SSRfinder軟件開發(fā)SSR。將可循環(huán)的序列及其互補(bǔ)序列進(jìn)行分類：如 AAC基序代表所有AAC、 ACA、 CAA、GTT、TGT 和 TTG 的SSR[15]。據(jù)此，將單核苷酸重復(fù)序列歸為 A/T，C/G 兩類，二核苷酸重復(fù)序列歸為AC/GT、AG/CT、AT/AT、CG/CG 4類，三核苷酸重復(fù)序列歸為10類，四核苷酸重復(fù)序列歸為 33類，五核苷酸重復(fù)序列歸為102類，六核苷酸重復(fù)序列歸為350類。

1.4　SSR-EST的功能分析

從NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫中下載7599條雄性不育相關(guān)序列(截止2013年6月)，與燕麥轉(zhuǎn)錄組EST序列進(jìn)行比對(duì)預(yù)測其功能。通過Blastx程序?qū)Π琒SR位點(diǎn)的EST序列進(jìn)行同源性比較，篩選同源蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)為：最大評(píng)分(maxscore)≥80，最大一致性(maxidentity)≥35%，Evalue<10-5；通過GO(Gene Ontology)注釋系統(tǒng)將獲得的SSR的EST序列進(jìn)行功能注釋和分類。

1.5　cSSR引物設(shè)計(jì)

基于燕麥EST-SSR重復(fù)單元前后的序列，應(yīng)用軟件Primer 3設(shè)計(jì)cSSR引物，每條SSR產(chǎn)生5對(duì)引物。引物篩選條件：引物不能存在SSR；將獲得的引物比對(duì)到EST序列，引物的5′端允許有3個(gè)堿基的錯(cuò)配，3′端允許有1個(gè)堿基的錯(cuò)配；去掉比對(duì)到不同EST上的引物，篩選得到唯一匹配的引物；使用SSR finder軟件和產(chǎn)物序列分析來校驗(yàn)SSR檢驗(yàn)結(jié)果是否與MISA軟件分析結(jié)果相同。通過評(píng)估的cSSR引物由北京六合華大科技有限公司進(jìn)行引物合成。

1.6　cSSR引物的篩選

2012年夏天取CAMS1×品燕2號(hào)F2群體五葉期的嫩綠葉片，以CTAB(hexadecyltrimethy ammonium bromide, CTAB)法提取基因組DNA。結(jié)合CAMS1×品燕2號(hào)F2:3群體的表現(xiàn)型，從F2群體中分別選取10份純合可育單株和10 株純合不可育單株的DNA進(jìn)行混合，建立可育池和不育池。利用親本和育性池驗(yàn)證和篩選引物。引物篩選分2個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行:前期篩選以獲得初步認(rèn)為與育性相關(guān)基因的引物對(duì)育性池進(jìn)行擴(kuò)增。在前期引物篩選(即初篩)環(huán)節(jié)，每次擴(kuò)增電泳同時(shí)檢測若干對(duì)引物，擴(kuò)增反應(yīng)體系為13 μL 10×Premix Taq(TaKaRa)，上游和下游引物各1 μL(10 μmol/L)，1 μL DNA(50 ng/μL)和4 μL超純水。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 5 min (1個(gè)循環(huán))；94℃ 30 s，55～65℃ 40 s，72℃ 30 s (35個(gè)循環(huán))，72℃ 10 min(1個(gè)循環(huán))。 根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果和已有經(jīng)驗(yàn)，在可育池和不育池完全無帶的引物都舍棄，認(rèn)為該引物無效。2012年11-12月完成45對(duì)cSSR引物的前期篩選，篩選時(shí)使用的退火溫度通常為56℃，少量引物使用60℃。然后，進(jìn)一步應(yīng)用初步認(rèn)為有效的引物對(duì)可育池和不育池進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系和程序同前期篩選所應(yīng)用的，但已根據(jù)初篩的擴(kuò)增情況來適當(dāng)調(diào)整了退火溫度。進(jìn)一步挑選在可育池和不育池之間存在差異的引物，然后利用親本和育性池進(jìn)一步驗(yàn)證和篩選引物。試驗(yàn)重復(fù)3次，擴(kuò)增產(chǎn)物分別用1.0%的瓊脂糖電泳和6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，每樣品點(diǎn)樣2 μL，電泳時(shí)間90 min。膠板在0.15% AgNO3溶液中銀染15 min，取出后蒸餾水速漂5 s，放入含有3%NaOH和0.5%甲醛的溶液中顯色10 min，視條帶清晰后轉(zhuǎn)入固定液終止反應(yīng)，蒸餾水清洗2 min后晾干、掃描。

2結(jié)果與分析

2.1　轉(zhuǎn)錄組得到的EST序列長度分布

采用Illumina HiSeqTM2000轉(zhuǎn)錄組測序組裝獲得100169條cDNA序列、總長為66580832 nt，其中300 nt的EST序列共30970條(30.92%)，400 nt的EST序列共18480條(18.45%)，500 nt的EST序列共10267條(10.25%)(圖1)。

圖1　EST序列長度分布Fig.1　EST sequence length distribution

2.2　燕麥EST序列中不同類型SSR的頻率

燕麥EST序列中有6409條EST序列包含1～6核苷酸重復(fù)的SSR位點(diǎn)，7275個(gè)SSR位點(diǎn)被找到，平均每9152.004 nt 的EST序列(66580832/7275)出現(xiàn)一個(gè)SSR，且每100條EST中出現(xiàn)7.26(7275/100169)個(gè)SSR，說明燕麥EST中SSR數(shù)量較為豐富。736個(gè)序列含2個(gè)及2個(gè)以上SSR位點(diǎn)，5673個(gè)(88.52%)EST只含有1個(gè)SSR位點(diǎn)。cSSR位點(diǎn)的總長度變化在12～197 nt之間，其中15 nt的最多，占35.74%；18，12和20 nt 的分別占14.28%，13.13%和7.16%。單、二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)基序最小,長度分別達(dá)到12，12，15，20，20，24 bp。在這些SSR位點(diǎn)中，三核苷酸重復(fù)的數(shù)量最多，共4340個(gè)(56.66%)，其次是二核苷酸(24.30%)、單核苷酸(6.10%)、四核苷酸(3.95%)、五核苷酸(3.53%)及六核苷酸(2.46%)(圖2)。其中約347個(gè)(4.77%)SSR為復(fù)合SSR。對(duì)于重復(fù)次數(shù)而言，六核苷酸和五核苷酸重復(fù)4次出現(xiàn)頻率最高，分別達(dá)到87.71%和89.88%；四核苷酸和三核苷酸基序的SSR中，5次重復(fù)頻率最高，分別為85.02%和47.09%(圖3)。

圖2　cSSR中不同SSR重復(fù)基元分布頻率Fig.2　Frequency distribution of cSSR motifs of A. sativa

圖3　SSR基元重復(fù)次數(shù)在燕麥EST序列中的分布頻率Fig.3　Frequency distribution of the number of cSSR repeats of A. sativa

2.3　燕麥EST-SSR中不同類型基序的分布頻率

在單堿基(444)重復(fù)的SSR中，A/T出現(xiàn)頻率最高(87.84%)，其次是C/G(12.16%)；二堿基(1768)重復(fù)的SSR序列中共搜索到AC/GT、AG/CT、AT/AT、CG/CG四類SSR基序，其中AG/CT出現(xiàn)頻率最高(60.63%)，其次是AC/GT(26.24%)和AT/AT(8.20%)；在三堿基(4340)重復(fù)的SSR序列中出現(xiàn)頻率最高的是CCG/CGG(26.68%)，而AGG/CTT(21.29%)、AGC/CTG(18.48%)、AAG/CTT(8.18%)及ACC/GGT(8.11%)次之，這5類基序所組成的SSR占三堿基SSR總數(shù)的82.74%，數(shù)量最少的三堿基基數(shù)為AAT/ATT，僅有29個(gè)(圖4)。同時(shí)在燕麥的EST中搜索四、五和六堿基重復(fù)的SSR分別有27，69，101種，其中AAAG/CTTT(10.45%)和AAGG/CCTT(9.41%)在四堿基重復(fù)SSR中(287)出現(xiàn)的頻率較高；AGAGG/CCTCT(11.28%)和AAAAG/CTTTT(5.45%)在五堿基重復(fù)SSR 中(257)出現(xiàn)頻率較高；ACGAGG/CCTCGT(2.79%)在六堿基重復(fù)SSR中(179)出現(xiàn)頻率較高。

圖4　二核苷酸和三核苷酸重復(fù)中不同重復(fù)基序的比例Fig.4　Percentage of different motifs in dinucleotide (A) and trinucleotide (B) repeats

分析燕麥EST數(shù)據(jù)庫中的SSR得出，在燕麥EST中最豐富的微衛(wèi)星類型是三堿基重復(fù)，其次為二堿基重復(fù)，主要的優(yōu)勢(shì)重復(fù)序列分別是GGC、GCG以及GA、CT類。

2.4　cSSR引物篩選和功能推測

按照引物設(shè)計(jì)要求設(shè)置基本檢索條件，共得到燕麥cSSR引物13344對(duì)。以“雄性不育”為檢索詞在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，再將結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組基因集進(jìn)行同源性比對(duì)，最終得到424條相關(guān)序列。用TBLASTX將設(shè)計(jì)引物的7275條燕麥EST序列與上述424條序列進(jìn)行同源性比對(duì)，篩選出96條燕麥EST序列，去除含有SSR位點(diǎn)但是長度不支持設(shè)計(jì)SSR引物的EST序列，得到21條與雄性不育相關(guān)的候選基因序列。

BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，21條燕麥育性候選基因中與短柄草(Brachypodiumdistachyon)同源的有9條，與大麥同源的有8條。這些基因涉及的通路主要為次生代謝產(chǎn)物合成(biosynthesis of secondary metabolites)、代謝通路(metabolic pathways)、淀粉和蔗糖合成(starch and sucrose metabolism)。

2.5　燕麥中與雄性不育相關(guān)基因的GO注釋分析

GO功能注釋分析結(jié)果表明，21條燕麥育性候選基因分布在分子功能、細(xì)胞組分和生物學(xué)過程3大類，以及更詳細(xì)的27個(gè)子類(圖5)。其中生物學(xué)過程功能類型中的細(xì)胞過程(cellular process GO：0009987)和代謝過程(metabolic process GO：0008152)所占比例最高，分別為68.2%和63.6%；細(xì)胞組分功能類型中，細(xì)胞(cell GO：0005623)、細(xì)胞部分(cell part GO：0044464)涉及的基因最多(cell GO：0005623為15條，cell part GO：0044464為15條)；分子功能類型中的催化活性(catalytic activity GO：0003824)和蛋白結(jié)合(binding GO：0005488)所含比例最高，為77.3%和63.6%。

圖5　21條候選基因 GO功能分類Fig.5　Gene ontology functional classification of 21 candidate genes　Ⅰ: 細(xì)胞組分Cellular component; Ⅱ: 分子功能Molecular function; Ⅲ: 生物過程Biological process. 1: 細(xì)胞Cell; 2: 細(xì)胞部分Cell part; 3: 外膜Envelope; 4: 胞外區(qū)Extracellular region; 5: 細(xì)胞器Organelle; 6: 細(xì)胞器部分Organelle part; 7: 合胞體Symplast; 8: 結(jié)合Binding; 9: 催化Catalytic; 10: 電子載體Electron carrier; 11: 酶的調(diào)節(jié)器Enzyme regulator; 12: 分子轉(zhuǎn)導(dǎo)Molecular transducer; 13: 轉(zhuǎn)運(yùn)Transporter; 14: 組織結(jié)構(gòu)的形成Anatomical structure formation; 15: 生物調(diào)節(jié)Biological regulation; 16: 細(xì)胞成分的生物合成Cellular component biogenesis; 17: 細(xì)胞成分的組織Cellular component organization; 18: 細(xì)胞過程Cellular process; 19: 發(fā)育過程Developmental process; 20: 生長Growth; 21: 代謝過程Metabolic process; 22: 多生物體過程Multi-organism process; 23: 多細(xì)胞生物過程Multicellular organismal process; 24: 著色Pigmentation; 25: 生殖Reproduction; 26: 生殖過程Reproductive process; 27: 響應(yīng)刺激Response to stimulus.

2.6　cSSR引物的驗(yàn)證

利用建立的可育池和不育池DNA為模板，對(duì)21個(gè)雄性不育候選基因?qū)?yīng)的45對(duì)cSSR引物進(jìn)行驗(yàn)證和篩選。對(duì)45對(duì)引物進(jìn)行初步篩選發(fā)現(xiàn)有32對(duì)引物(表1)能在燕麥中成功擴(kuò)增出條帶，初步認(rèn)為這些引物是有效引物。利用這些引物對(duì)親本和育性池進(jìn)行進(jìn)一步篩選發(fā)現(xiàn)其中11對(duì)引物在親本間具有多態(tài)性(表1中編號(hào)2~12)，7對(duì)引物在可育和不育性狀池間存在差異(表1中編號(hào)1~7),引物CL1163_134_1、CL2383_248_2和nigene22206_2260_1 (表中編號(hào)1~3)只在不育池中有條帶，可育池中沒有條帶(圖6)，可用于苗期鑒別燕麥雄性不育株與可育株。

表1　32對(duì)cSSR引物

3討論

圖6　部分引物在兩個(gè)性狀池間的多態(tài)性　　Fig.6　Polymorphisms of some primers in oat two traits pools　　　F：可育材料Fertile materials；S：不育材料Sterile materials；1：CL10421_976_3；2：CL1163_134_1；3：CL22881_1791_3；4：CL2383_248_1；5：CL2383_248_2；6：CL2383_248_4；7：CL4288_411_1；8：Unigene22206_2260_1；M：DNA marker DL500.

3.1　皮燕麥隱性核不育相關(guān)SSR標(biāo)記的開發(fā)

EST序列來源于保守型較高的編碼DNA，可直接反映相關(guān)基因的功能，在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中已被作為一個(gè)重要的使用工具。截止2014年4月NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的燕麥EST序列為79657條，與小麥(1358140條)、大麥(537546條)、水稻(1369506條)等禾本科作物相比燕麥EST序列數(shù)據(jù)明顯不足。在利用EST進(jìn)行燕麥的cSSR標(biāo)記開發(fā)方面，Br?utigam等[16]利用測序技術(shù)對(duì)不同溫度條件下生長的燕麥進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)9792條EST序列，確定了2800個(gè)與冷誘導(dǎo)相關(guān)的基因，其中51條基因是以前報(bào)道過與冷誘導(dǎo)相關(guān)的基因，并證明CBF轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)冷馴化中有重要作用，并開發(fā)400對(duì)與冷誘導(dǎo)相關(guān)cSSR標(biāo)記。本研究在國內(nèi)首次利用皮燕麥隱性核不育材料進(jìn)行SSR開發(fā)，根據(jù)獲得的燕麥隱形核不育EST序列，開發(fā)了13344對(duì)引物。經(jīng)過生物信息學(xué)同源比對(duì)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，7對(duì)SSR引物可作為燕麥可育和不育性狀的評(píng)價(jià)引物，為燕麥的育性分子標(biāo)記研究以及育種方法的改進(jìn)奠定基礎(chǔ)。

3.2　EST中簡單重復(fù)序列(cSSR)的分布特點(diǎn)

SSRs 分布于基因間隔區(qū)和基因編碼區(qū)。對(duì)大麥、小麥、燕麥和玉米(Zeamays)等禾谷類作物EST中cSSR的含量、出現(xiàn)頻率、重復(fù)類型等的研究表明，7%～10%的EST序列含有cSSR，其中3%可用于cSSR引物設(shè)計(jì)。cSSR在大麥、小麥、燕麥、黑麥(Secalecereale)、玉米、高粱和水稻中出現(xiàn)的頻率分別為7.5，6.2，5.5，7.5，5.5 和3.9 kb，平均6.0 kb 就出現(xiàn)一個(gè)cSSR。其中三核苷酸重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)最多(54%～78%)，其次為二核苷酸重復(fù)類型(17%～40%)，而四核苷酸以上重復(fù)類型較少[17]。

Gao等[18]發(fā)現(xiàn)，許多三核苷酸與具有重要功能的基因相關(guān)，如CCG重復(fù)涉及許多基因的功能，如脅迫抗性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)等許多基因的功能。二核苷酸重復(fù)單元AG/CT在mRNA 中根據(jù)不同的閱讀起始位點(diǎn)可以分別讀為:GAG、AGA、UCU 和CUC，從而分別翻譯為Arg、Glu、Ala 和Leu，而Ala 和Leu在蛋白質(zhì)中出現(xiàn)的頻率高達(dá)8%和10%[19]。在本研究中，三核苷酸重復(fù)基元的SSR類型最多(4340個(gè)，56.66%)， 其中CCG/CGG(26.68%)和AGG/CTT(21.29%)出現(xiàn)頻率最高，這兩類重復(fù)類型占了三核苷酸重復(fù)類型總量的50%以上，而其他重復(fù)類型則相對(duì)較少。二核苷酸重復(fù)中(1768個(gè)，24.30%)，含AG/CT 重復(fù)單元的最多，而含CG/CG重復(fù)單元的數(shù)量最少。這些和大麥[20]、小麥[21]、水稻[22]以及玉米[23]4種禾本科作物EST序列SSR的分布規(guī)律相似[24]。

Temnykh等[25]按照SSR長度將微衛(wèi)星分為兩大類：長度≥20 bp的SSR和長度>12 bp但<20 bp的SSR。與第2類SSR相比，第1類SSR序列長度更長，具有更高的突變率，因而更不穩(wěn)定。SSR一般被認(rèn)為是由于DNA復(fù)制過程中聚合酶瞬時(shí)脫離、堿基錯(cuò)配引起的，cSSR的多態(tài)性主要是由于重復(fù)長度和重復(fù)次數(shù)造成的[26], 菊花(Chrysanthemum)EST序列中SSR重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)為1～13次，最大的重復(fù)次數(shù)出現(xiàn)在三核苷酸中，詹少華等[27]統(tǒng)計(jì)了SSR基元重復(fù)次數(shù)變異范圍，推測SSR基元重復(fù)次數(shù)變異范圍越大，分子標(biāo)記的多態(tài)性就越高，認(rèn)為SSR重復(fù)基元重復(fù)次數(shù)變異的發(fā)生與SSR形成有關(guān)。本試驗(yàn)對(duì)7275個(gè)微衛(wèi)星長度進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，燕麥EST序列所含的微衛(wèi)星在長度上存在顯著變異，微衛(wèi)星長度為12～197 bp，平均19 bp。長度大于20 bp的有1066條，這些較長的序列變異較大，其多態(tài)性較豐富，有利于cSSR標(biāo)記的開發(fā)[28]。在燕麥cSSR位點(diǎn)中重復(fù)最長的出現(xiàn)在二核苷酸中，為197 bp。7對(duì)在可育和不育性狀池間存在差異的引物涉及6條序列，分布在二核苷酸GC、TG和三核苷酸GCT、CAG和TCG，大小為12～18 bp，重復(fù)次數(shù)為5～8次。在可育和不育性狀間存在差異分子標(biāo)記的開發(fā)，有利于不育植株的鑒別工作提前開展，獲得大量的雜交種子。

4結(jié)論

本研究利用生物信息學(xué)軟件對(duì)燕麥雄蕊發(fā)育EST庫中的cSSR位點(diǎn)分布特征進(jìn)行了分析，了解了燕麥育性材料轉(zhuǎn)錄組中基因轉(zhuǎn)錄序列所含微衛(wèi)星重復(fù)序列的特征和組成情況，后根據(jù)發(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)了cSSR引物，在此基礎(chǔ)上開發(fā)了燕麥育性相關(guān)的SSR標(biāo)記，并對(duì)這些標(biāo)記在燕麥育性鑒別上進(jìn)行了初步驗(yàn)證。通過燕麥SSR標(biāo)記開發(fā)，將其用于燕麥遺傳多樣性檢測，有助于燕麥屬植物分子水平的研究，對(duì)中國燕麥種質(zhì)資源多樣性的分析、連鎖圖譜構(gòu)建、比較基因組學(xué)等研究也具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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