潘金春，任柏樺, 閔凡貴，陳瑞愛(ài)，王希龍，

王林川3，4，王鳳國(guó)3，羅書(shū)明3，葉健聰3， 劉　玲3，黃鵬華3

(1. 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣東 廣州　510663；2. 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州　510663；

3.廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司，廣東 新興　527400; 4. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州　510642)

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不同品系小型豬對(duì)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的敏感性篩選

潘金春1,2，任柏樺3,4, 閔凡貴1,2，陳瑞愛(ài)3，4，王希龍1,2，

王林川3，4，王鳳國(guó)3，羅書(shū)明3，葉健聰3，劉玲3，黃鵬華3

(1. 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣東 廣州510663；2. 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510663；

3.廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司，廣東 新興527400; 4. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州510642)

【摘要】目的篩選對(duì)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)敏感的小型豬品系，以用于HP-PRRS活疫苗的評(píng)價(jià)。方法本研究選擇藍(lán)塘豬、蕨麻小型豬、巴馬小型豬、五指山小型豬(白系)接種PRRSV NVDC-JXA1株強(qiáng)毒，并以本地二元雜豬作為對(duì)照。攻毒后每天觀察動(dòng)物精神、食欲、死亡等情況，死亡動(dòng)物進(jìn)行剖檢，并采取肺組織做RT-PCR檢測(cè)病毒，連續(xù)觀察5周，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)采取存活動(dòng)物血清分別檢測(cè)PRRSV抗體。結(jié)果 攻毒后各組都有動(dòng)物出現(xiàn)精神沉郁、食欲下降、死亡等現(xiàn)象，死亡動(dòng)物RT-PCR檢測(cè)都顯示為陽(yáng)性，存活動(dòng)物PRRSV抗體檢測(cè)陽(yáng)性。從死亡率看，巴馬小型豬和五指山小型豬白系對(duì)PRRSV NVDC-JXA1株強(qiáng)毒的敏感性最高，并且敏感性超過(guò)了對(duì)照組二元雜豬。結(jié)論巴馬小型豬和五指山小型豬白系對(duì)HP-PRRSV敏感，可用于HP-PRRS活疫苗的檢驗(yàn)。

【關(guān)鍵詞】小型豬；高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒；敏感性篩選

Susceptibility screening of highly pathogenic porcine reproductive and

豬繁殖與呼吸道綜合征 (porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又稱為藍(lán)耳病，是目前全球養(yǎng)豬業(yè)面臨的最重要的傳染病之一，并給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失，據(jù)估計(jì)2004年給美國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成約5.6億美元的損失，高于豬瘟的3.64億美元和偽狂犬病的0.36億美元[1]，而到2011年P(guān)RRS造成的損失金額上升到了6.44億美元[2]。我國(guó)是世界上最大的養(yǎng)豬與豬肉消費(fèi)大國(guó)，PRRS也嚴(yán)重威脅著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的安全，特別是2006年我國(guó)南方部分省市發(fā)現(xiàn)的高致病性PRRS(highly pathogenic PRRS，HP-PRRS)給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，該病是由于高致病性的PRRSV變異株(NVDC—JXA1株)引起的[3]。

目前PRRS沒(méi)有特異的治療方法，疫苗免疫仍是最主要的防控措施[4]，有臨床應(yīng)用證實(shí)[5]，HP-PRRS活疫苗可以大幅度降低豬的PRRS疫病發(fā)病率及死亡率，免疫效果十分理想。根據(jù)農(nóng)業(yè)部第1548號(hào)公告[6]，HP-PRRS活疫苗需要進(jìn)行安全檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)，而這兩項(xiàng)都要用健康易感豬來(lái)進(jìn)行檢驗(yàn)。目前HP-PRRS疫苗檢驗(yàn)用的易感豬主要為從本地收購(gòu)的二元雜豬。

研究證明，豬不但在解剖學(xué)、生理學(xué)、代謝和疾病發(fā)生機(jī)理等方面與人體十分接近，還有易于飼養(yǎng)和捕捉，繁殖周期短，多產(chǎn)等特性，是理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。與普通家豬相比，小型豬體型較小便于實(shí)驗(yàn)處理和飼養(yǎng)管理，成本較低，遺傳選擇、遺傳控制也更符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的要求[7]。目前小型豬已經(jīng)在生命科學(xué)領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用，標(biāo)準(zhǔn)化程度較高。而從本地收購(gòu)的二元雜豬標(biāo)準(zhǔn)化程度較低，背景不清，也有可能存在由于疫病流行等原因造成供應(yīng)不足的威脅。

為選擇合適的敏感小型豬種，本研究對(duì)藍(lán)塘豬、蕨麻小型豬、巴馬小型豬、五指山小型豬這幾種小型豬種進(jìn)行了HP-PRRSV攻毒試驗(yàn)，以便篩選出合適的小型豬種用于HP-PRRS活疫苗的檢驗(yàn)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

藍(lán)塘豬來(lái)源于連平縣深連生態(tài)農(nóng)牧發(fā)展有限公司，數(shù)量為10頭；蕨麻小型豬、巴馬小型豬、五指山小型豬來(lái)源于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所和大華農(nóng)公司合作建立的小型豬繁育基地，其中五指山小型豬為近交群白系，數(shù)量分別為10頭、8頭和3頭；二元雜豬從本地購(gòu)得，數(shù)量為5頭，作為對(duì)照組。各豬種4周齡左右，雌雄不限。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK(粵)2013-0022，設(shè)施使用許可證號(hào)為：SYXK(粵)2013-0087。各豬種試驗(yàn)前采血清檢測(cè)PRRSV抗體都呈陰性。

1.2毒株

HP-PRRSV NVDC-JXA1強(qiáng)毒株由中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供，用Marc-145細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)得TCID50為105.0/mL，1:5稀釋備用。

1.3試劑及儀器

PRRSV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒由IDEXX公司提供，PRRSV RT-PCR檢測(cè)試劑盒由世紀(jì)元亨提供，PCR儀為Eppendorf 5333。

1.4接種

每頭豬的攻毒量為2 mL，其中病毒含量為6 × 104.0TCID50，接種方法為肌內(nèi)注射。

1.5觀察內(nèi)容

接種后每天觀察動(dòng)物精神、食欲、死亡等情況，死亡動(dòng)物進(jìn)行剖檢，連續(xù)觀察5周。

1.6病毒檢測(cè)

試驗(yàn)中死亡動(dòng)物采取肺組織，采用RT-PCR方法檢測(cè)PRRSV，主要步驟如下：病毒RNA抽提→RT-PCR擴(kuò)增(42℃ 45 min，95℃ 3 min；循環(huán)94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共35次；再72℃延伸7 min)→電泳；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)存活動(dòng)物前腔靜脈叢采血3 mL，分離血清檢測(cè)PRRSV抗體。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

動(dòng)物死亡情況用SPSS 16.0軟件制作成生存曲線。

2結(jié)果

2.1 一般觀察

攻毒后從第4天開(kāi)始各組陸續(xù)有動(dòng)物出現(xiàn)精神沉郁、食欲下降現(xiàn)象，部分豬表現(xiàn)氣喘、呼吸困難，并都有動(dòng)物出現(xiàn)死亡，具體發(fā)病時(shí)間及發(fā)病率參見(jiàn)表1。

表1　各組動(dòng)物發(fā)病時(shí)間及發(fā)病率

圖1　攻毒后各組生存曲線Fig.1　Survival curves of the minipigs of each group after inoculation

2.2死亡情況

攻毒后各組動(dòng)物生存曲線見(jiàn)圖1，動(dòng)物死亡時(shí)間在接種后15 d～21 d之間。從死亡率來(lái)看，巴馬小型豬和五指山小型豬白系最高，都達(dá)到了100%，藍(lán)塘豬、蕨麻小型豬都為40%，對(duì)照組二元雜豬為60%。

2.3 病理剖檢

死亡動(dòng)物剖檢可見(jiàn)肺局部有灶性實(shí)變以及充血、出血變化，病變主要出現(xiàn)在肺心葉和尖葉。此外還有腹股溝淋巴結(jié)、扁桃體出現(xiàn)腫大、出血，皮下、肝臟、腎臟可見(jiàn)出血點(diǎn)或出血斑等病變。

2.4 病毒檢測(cè)

2.4.1RT-PCR：所有死亡動(dòng)物都出現(xiàn)436 bp的特征性電泳條帶(圖2)，可判斷結(jié)果為陽(yáng)性。

2.4.2PRRSV抗體：未死亡動(dòng)物抗體檢測(cè)全為陽(yáng)性。

3討論

PRRS可以引起豬呼吸障礙、免疫抑制、生長(zhǎng)緩慢、生產(chǎn)性能下降、繁殖性能下降，甚至死亡，可通過(guò)接觸感染、空氣傳播、精液傳播和垂直傳播等多種途徑傳播，是一種高度接觸性傳染病，并可持續(xù)性感染，是養(yǎng)豬業(yè)的一個(gè)重大威脅[8]。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，目前我國(guó)所流行的PRRSV基本上均屬于HP-PRRSV，臨床樣品的陽(yáng)性率達(dá)到35.9%～60.8%[9]。因此HP-PRRS的防控尤為重要。

注：1～22泳道分別為藍(lán)塘豬(4頭)、蕨麻小型豬(4頭)、巴馬小型豬(8頭)、五指山小型豬(3頭)、二元雜豬(3頭)；23泳道為marker(DL2000)；24泳道為陰性對(duì)照；25泳道為陽(yáng)性對(duì)照(436 bp條帶)圖2　RT-PCR檢測(cè)電泳圖Note. Tracks 1～22: Lantang minipigs (4), Juema minipigs (4), Bama minipigs (8), Wuzhishan minipigs (3), Binary hybrid pigs (3); Track 23: DNA marker (DL2000); Track 24: Negative control; Track 25: Positive control (436 bp)Fig.2　The patterns of RT-PCR electrophoregram

本研究選取的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都為PRRSV抗體陰性，而攻毒后動(dòng)物出現(xiàn)了PRRS的典型癥狀和病變，RT-PCR檢測(cè)為陽(yáng)性，存活動(dòng)物的PRRSV抗體全為陽(yáng)性，說(shuō)明動(dòng)物死亡是由HP-PRRSV造成的，符合農(nóng)業(yè)部《高致病性豬藍(lán)耳病防治技術(shù)規(guī)范》高致病性藍(lán)耳病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

接種HP-PRRS活疫苗是防控PRRS的有效方法，而檢驗(yàn)該疫苗需要使用對(duì)HP-PRRSV NVDC-JXA1強(qiáng)毒株敏感的豬種，并且該豬種攻毒后21 d死亡率要達(dá)到40%(2/5)以上[6]。本研究中所有動(dòng)物的死亡時(shí)間在接種后15 d～21 d之間，符合21d內(nèi)死亡的要求；對(duì)照組二元雜豬死亡率達(dá)到60%，符合第1548號(hào)公告40%以上死亡率的要求，本次試驗(yàn)結(jié)果能夠成立；從豬種上看，所有動(dòng)物都出現(xiàn)死亡，且死亡率達(dá)到40%或40%以上，說(shuō)明這4種豬對(duì)PRRS都有一定的敏感性；其中巴馬小型豬和五指山小型豬白系死亡率達(dá)到100%，初步說(shuō)明這兩種小型豬對(duì)PRRS比較敏感，其敏感性超過(guò)了對(duì)照組二元雜豬，可用于HP-PRRS活疫苗的檢驗(yàn)。

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[2]Holtkamp DJ, Kliebenstein JB, Neumann EJ, et al. Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers [J]. J Swine Health Prod. 2013, 21(2): 72-84.

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〔修回日期〕2015-04-21

研究報(bào)告

respiratory syndrome virus in several strains of minipigs

PAN Jin-chun1,2, REN Bo-hua3，4, MIN Fan-gui1,2,CHEN Rui-ai3，4, WANG Xi-long1,2, WANG Lin-chuan3，4,

WANG Feng-guo3, LUO Shu-ming3,YE Jian-cong3, LIU Ling3, HUANG Peng-hua3

(1. Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Guangzhou 510663, China;

2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangzhou 510663;

3.Guangdong Dahuanong Animal Health roducts Stock Co., Ltd., Xinxing 527400;

4. South China Agricultural University, College of Veterinary Medicine, Guangzhou 510642)

【Abstract】ObjectiveTo screenstrains of minipigs sensitive to highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV) for evaluation of HP-PRRS live vaccine. Methods Lantang pigs, Juema, Bama and Wuzhishan (white) minipigs were inoculated with virulent strain NVDC-JXA1 of PRRSV, and local binary hybrid pigs were used as control. The animals were continuously observed for 5 weeks on mental status, appetite, survival, etc. after inoculation of virus. The dead pigs were autopsied and the lung tissue samples were collected for detecting virus by RT-PCR. By the end of the experiment, serum of survival animals were collected for detecting PRRSV antibody by ELISA assay. ResultThe animals showed depression, anorexia, and other clinical signs and death in each group after inoculation. Meanwhile, the testing results were all positive in the RT-PCR and ELISA detection. Bama and Wuzhishan (white) minipigs were the most sensitive to virulent strain NVDC-JXA1 of PRRSV regarding mortality rate. ConclusionsBama and Wuzhishan (white) minipigs are sensitive to HP-PRRSV, and can be used for the inspection of HP-PRRS live vaccine.

【Key words】Minipigs；Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS; Highly pathogenic PRRS virus, HP-PRRSV; Susceptibility screening

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.006.003

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2015) 06-0014-04

[通訊作者]王希龍(1963- )，男，博士，研究員，研究方向：小型豬遺傳育種與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化。Email : wangxilonggd@163.com；王林川，男，博士，教授，Email : lcwang65@163.com。

[作者簡(jiǎn)介]潘金春(1979-)，男，碩士，助理研究員，研究方向：比較醫(yī)學(xué)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)測(cè)。Email： jcpan@sina.com；任柏華(1988-)，男，研究方向：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)。Email： 764684361@qq.com。

[基金項(xiàng)目]廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012B060300001)，廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(2012B091100466)。