李曉波，付　瑞，王　吉，衛(wèi)　禮，王淑菁，岳秉飛，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京　100050)

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大鼠細(xì)小病毒H-1株和KRV株雙重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

李曉波，付瑞，王吉，衛(wèi)禮，王淑菁，岳秉飛，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京100050)

【摘要】目的建立大鼠細(xì)小病毒H-1和KRV株雙重PCR方法并對方法進(jìn)行初步應(yīng)用。 方法 根據(jù)NCBI發(fā)表的H-1(NC001358)和KRV(U790330)基因組序列分別設(shè)計(jì)特異引物，以H-1和KRV 病毒DNA為模板建立雙重PCR方法，對方法進(jìn)行優(yōu)化后驗(yàn)證方法的敏感性和特異性；經(jīng)口感染大鼠，分為H-1和KRV單獨(dú)感染組和混合感染組，感染后第2，4，6，8，10天采集大鼠糞便，第10天處死所有大鼠，采集心、肝、脾、肺、腎和盲腸內(nèi)容物等組織，用建立的方法對糞便和組織樣本進(jìn)行檢測。結(jié)果建立的雙重PCR方法以H-1和KRV為模板能夠分別擴(kuò)增出183 bp和302 bp 2個(gè)條帶，敏感性驗(yàn)證顯示能夠檢測到的最低H-1量為3.8 pg/mL，最低KRV量為0.73 pg/mL；在以小鼠微小病毒、犬細(xì)小病毒和貓細(xì)小病毒為模板時(shí)無任何條帶擴(kuò)增出，特異性良好。感染第2天在所有大鼠糞便中均檢測到病毒核酸，感染大鼠均無明顯臨床癥狀，感染第10天采集組織，H-1在各組織的檢出率分別是心50%(4/8)，肝50%(4/8)，脾62.5%(5/8)，肺50%(4/8)，腎37.5%(3/8)，盲腸內(nèi)容物62.5%(5/8)，且單獨(dú)感染組檢出率高于混合感染組；KRV在各組織的檢出率分別是心0(0/8)，肝25%(2/8)，脾87.5%(7/8)，肺12.5%(1/8)，腎25%(2/8)，盲腸內(nèi)容物62.5%(5/8)，混合感染組檢出率高于單獨(dú)感染組。結(jié)論建立的H-1和KRV雙重PCR方法能夠高效的檢測大鼠糞便及組織中的病毒感染，可作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)的有力補(bǔ)充。

【關(guān)鍵詞】大鼠細(xì)小病毒；H-1；KRV；雙重PCR

大鼠細(xì)小病毒(rat parvovirus, RPV)是對實(shí)驗(yàn)大鼠危害最為嚴(yán)重的病毒之一，分類上屬細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬。Kilham等[1]從患腫瘤的大鼠體內(nèi)首次分離到RPV，通常稱為Kilham大鼠病毒(Kilham rat virus, KRV)；隨后Toolan 等[2]從經(jīng)大鼠傳代的人腫瘤細(xì)胞系(HEP- 1)分離到得第2株RPV，通常稱為H-1病毒，又稱 Toolan 病毒。RPV在野生大鼠中有較高的感染率，成年大鼠感染多無臨床癥狀，但感染鼠可通過糞便長期向外排毒，污染飼料、飲水和周圍環(huán)境，并重新感染易感動(dòng)物，造成RPV在鼠群中持續(xù)存在。RPV還可污染腫瘤移植物和細(xì)胞系，對實(shí)驗(yàn)研究造成嚴(yán)重干擾[3]。我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 14922.2-2011)規(guī)定大鼠細(xì)小病毒KRV和H-1株為SPF實(shí)驗(yàn)大鼠病毒的必檢項(xiàng)目[4]。

本實(shí)驗(yàn)建立了大鼠細(xì)小病毒H-1株和KRV株的雙重PCR方法，能夠在同一反應(yīng)體系里同時(shí)檢測H-1株和KRV株，縮短了檢測時(shí)間，提高了檢測效率。

1材料

1.1試劑

PCR相關(guān)試劑購自Takara公司；DNA提取試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品。

1.2病毒毒株

大鼠細(xì)小病毒H-1和KRV株、小鼠微小病毒(MVM)、犬細(xì)小病毒均為本室保存，貓細(xì)小病毒購自ATCC。

1.3SPF大鼠

13只，購自本所動(dòng)物生產(chǎn)供應(yīng)室，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0013，使用許可證號(hào)：SYXK(京)2011-0008，品系SD，8周齡，雌雄各半。

2方法

2.1引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI發(fā)表的大鼠細(xì)小病毒H-1株(NC_001358)和KRV株(U790330)基因組序列分別設(shè)計(jì)特異引物，擴(kuò)增區(qū)域均為病毒的衣殼蛋白，兩對引物間無交叉反應(yīng)(表1)。

表1　大鼠細(xì)小病毒雙重PCR引物

2.2 病毒DNA的提取

大鼠細(xì)小病毒H-1和KRV株C6細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)3次凍融后，分別取200 μL按試劑盒的操作說明提取DNA，作為雙重PCR反應(yīng)的模板，同時(shí)提取各對照病毒DNA。

2.3 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

對雙重PCR反應(yīng)體系dNTP濃度、HS Taq酶量、H-1和KRV引物比例、引物濃度及退火溫度等進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件。

2.4 敏感性測定

紫外分光光度法測定H-1和KRV模板DNA濃度，分別進(jìn)行10-1～10-10系列稀釋，用建立的PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，檢測方法的靈敏度。

2.5特異性測定

分別以KRV和H-1混合DNA、KRV、H-1、小鼠微小病毒、犬細(xì)小及貓細(xì)小病毒DNA為模板進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，陽性PCR產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行核酸序列測定，驗(yàn)證方法的特異性。

2.6初步應(yīng)用

12只SPF大鼠分為3組，每組4只，第1組按200 μL/只的劑量經(jīng)口感染H-1，第2組按同樣方式感染KRV，第3組同時(shí)感染H-1和KRV，最后1只為陰性對照。感染后第2，4，5，6，10天采集大鼠糞便，加入適量PBS懸浮離心，上清過濾除菌，取200 μL提取DNA進(jìn)行雙重PCR檢測。第10天處死所有大鼠，無菌采集心、肝、脾、肺、腎和盲腸內(nèi)容物等組織，提取DNA后進(jìn)行檢測。

3結(jié)果

3.1PCR反應(yīng)體系及條件

優(yōu)化后的反應(yīng)體系為10× PCR buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，2對引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，HS Taq酶0.5 μL，最后加滅菌雙蒸水補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件為94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。

3.2PCR產(chǎn)物測序

提取H-1和KRV細(xì)胞培養(yǎng)物DNA，用建立的雙重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行測序，序列經(jīng)NCBI Blast比對，結(jié)果見圖1，符合率均為99%。

3.3敏感性測定

紫外分光法測得H-1 DNA模板濃度為384.52 ng/mL，KRV為732.42 ng/mL。由圖2可見，單一PCR檢測限均為10-7，即單一PCR能夠檢出的最低濃度分別為H-1 0.38 pg/mL，KRV 0.73 pg/mL；雙重PCR檢測限為H-1 10-6，KRV10-7，檢出的最低濃度為H-13.8 pg/mL，KRV0.73 pg/mL(圖3)。

3.4特異性測定

用建立的雙重PCR方法分別擴(kuò)增KRV和H-1混合DNA、單獨(dú)KRV或H-1、小鼠微小病毒、犬細(xì)小及貓細(xì)小病毒，結(jié)果顯示(圖4)，該雙重PCR方法與小鼠細(xì)小、犬細(xì)小和貓細(xì)小均無交叉反應(yīng)，KRV和H-1相互間也無交叉反應(yīng)。

3.5初步應(yīng)用

所有大鼠均無明顯臨床癥狀，感染后第2天在感染大鼠的糞便中均檢測到相應(yīng)的目的條帶(圖5)，通過測序證實(shí)為相應(yīng)的病毒；取感染大鼠的心、肝、脾、肺、腎和盲腸內(nèi)容物等組織進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示H-1在各組織的檢出率分別是心50%(4/8)，肝50%(4/8)，脾62.5%(5/8)，肺50%(4/8)，腎37.5%(3/8)，盲腸內(nèi)容物62.5%(5/8)，單獨(dú)感染組檢出率高于混合感染組；KRV在各組織的檢出率分別是心0(0/8)，肝25%(2/8)，脾87.5%(7/8)，肺12.5%(1/8)，腎25%(2/8)，盲腸內(nèi)容物62.5%(5/8)，混合感染組檢出率高于單獨(dú)感染組。對照小鼠各組織中均未檢出H-1或KRV，具體見表2。監(jiān)測感染大鼠糞便排毒情況，第10天仍能檢測到KRV排出(表3)。

4討論

血清學(xué)方法是目前診斷實(shí)驗(yàn)大鼠中H-1和KRV感染的常用方法，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國標(biāo)中規(guī)定的血清學(xué)方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，免疫酶試驗(yàn)(IEA)，免疫熒光試驗(yàn)(IFA)和血凝抑制試驗(yàn)(HIA)，ELISA或IFA一般用做大規(guī)模的篩查，HIA一般用來做確證試驗(yàn)[4]。ELISA和IFA敏感性較高，但由于細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白比較保守，會(huì)產(chǎn)生抗體間的交叉反應(yīng)，因而方法的特異性較差，同時(shí)血清學(xué)方法也不適用病毒在動(dòng)物間急性感染而血清還未發(fā)生陽轉(zhuǎn)的情況[5]。PCR方法以其較高的靈敏度和特異性已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病毒的檢測，本試驗(yàn)建立了大鼠H-1和KRV的雙重PCR檢測方法，特異性好，靈敏度高，能夠在同一反應(yīng)體系中同時(shí)檢測并區(qū)分H-1和KRV，與傳統(tǒng)的PCR方法[5,6]相比提高了檢測效率。

表2　各感染組大鼠組織中病毒的分布情況

表3　感染后不同時(shí)間糞便中病毒監(jiān)測結(jié)果

圖1　H-1 and KRV PCR產(chǎn)物測序結(jié)果比對Fig.1　Comparison of the BLAST results of PCR products sequencing of H-1 and KRV

A：H-1 B：KRVM:100 bp marker; 1～10: DNA模板分別10-1～10-10稀釋圖2　單一PCR敏感性結(jié)果M: 100 bp marker; 1 to 10: 10-1 to 10-10 dilution of H-1 or KRV DNAFig.2　The sensitivity results of single PCR assay

M:100 bp marker; 1～10: H-1和KRV cDNA模板分別10-1～10-10稀釋圖3　大鼠細(xì)小病毒雙重PCR敏感性結(jié)果M: 100 bp marker; 1 to10: 10-1 to10-10 dilution of H-1 and KRV DNAFig.3　The sensitivity results of duplex PCR assay of RPV

1～6： KRV和H-1混合模板、KRV、H-1、MVM、犬細(xì)小、貓細(xì)小病毒圖4　大鼠細(xì)小病毒雙重PCR特異性結(jié)果1 to 6: KRV and H-1 mixed templete, KRV, H-1, MVM, CPV, FPVFig.4　The specificity results of duplex PCR of RPV

1～4：H-1單獨(dú)感染組；5～8：KRV單獨(dú)感染組；9～12：混合感染組圖5　感染第2天大鼠糞便中RPV檢測結(jié)果1 to 4: H-1 infection group; 5 to 8: KRV infection group；9 to 12: H-1 & KRV infection groupFig.5　The results of duplex PCR assay for RPV of rat feces collected on the 2th day

通過比較不同細(xì)小病毒毒株的基因組序列，我們選擇H-1和KRV特有的區(qū)域設(shè)計(jì)了2對引物，擴(kuò)增的區(qū)域均位于衣殼蛋白基因，每對引物只能特異的擴(kuò)增相應(yīng)毒株，與其他毒株無交叉反應(yīng)，特異性驗(yàn)證顯示針對H-1的引物在以H-1 DNA為模板時(shí)能夠擴(kuò)增特定大小的單一目的片段，以KRV、MVM及貓、犬等哺乳動(dòng)物細(xì)小病毒為模板無任何條帶出現(xiàn)；KRV也同樣如此，說明方法的特異性良好。先前報(bào)道的PCR方法[7]雖然也能夠特異的擴(kuò)增H-1和KRV，但兩者的PCR產(chǎn)物大小相近，電泳不容易區(qū)分，無法在同一反應(yīng)體系中建立雙重PCR方法，本試驗(yàn)2對特異引物擴(kuò)增的片段大小分別為183 bp和302 bp，電泳能夠很好的區(qū)分，適合在同一反應(yīng)體系中同時(shí)檢測H-1和KRV，大大提高了檢測效率。

對方法的敏感性測定顯示H-1和KRV在單獨(dú)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)敏感性相差不大，檢測的最小DNA濃度分別為0.38 pg/mL和0.73 pg/mL，而在同一體系進(jìn)行雙重PCR時(shí)KRV的敏感性無變化，H-1的敏感性降低了一個(gè)數(shù)量級，為3.8 pg/mL，即使對雙重體系進(jìn)行優(yōu)化敏感性仍沒有顯著提高，如何將兩個(gè)反應(yīng)間的影響降至最低是后續(xù)方法優(yōu)化的重點(diǎn)。

大鼠細(xì)小病毒感染后可通過糞便長期排毒，我們經(jīng)口感染大鼠，定期采集糞便用建立的雙重PCR方法進(jìn)行檢測，感染第2天即在所有感染大鼠糞便中檢出相應(yīng)病毒，感染大鼠均無明顯臨床癥狀，感染第10天仍能夠檢出KRV，但均未檢出H-1，說明KRV在大鼠體內(nèi)能夠持續(xù)存在并向外排毒，這與文獻(xiàn)報(bào)道相符[8]；H-1雖然在糞便中未檢出，但在大鼠的組織樣本中能夠檢測到，說明H-1可能在大鼠體內(nèi)潛伏感染。由于實(shí)驗(yàn)樣本有限，H-1的感染特征還需進(jìn)一步研究證實(shí)。我們還用該方法檢測了感染大鼠心、肝、脾、肺、腎和盲腸內(nèi)容物中病毒的分布情況，結(jié)果顯示H-1在心、肝、脾、肺、腎和盲腸內(nèi)容物中均有分布，單獨(dú)感染組檢出率高于H-1&KRV混合感染組；KRV在心組織未檢出，在脾中的檢出率明顯高于其他組織，且混合感染組檢出率高于單獨(dú)感染組，說明H-1的同時(shí)感染可能對KRV的感染有協(xié)同作用，這有待進(jìn)一步證實(shí)。

考慮到各種影響檢測的因素，筆者認(rèn)為要獲得最佳的檢測結(jié)果，需要注意以下兩點(diǎn)：(1)樣本采集后最好馬上處理，不能馬上處理的需-70℃保存，避免反復(fù)凍融。(2)由于糞便中雜質(zhì)較多，有可能存在影響病毒核酸提取的物質(zhì)，建議采用糞便專用的核酸提取試劑盒，去除糞便中的雜質(zhì)干擾。本實(shí)驗(yàn)未對大鼠血清及全血樣本進(jìn)行檢測，不能確定動(dòng)物是否產(chǎn)生病毒血癥及組織器官中病毒為血液來源還是組織特異富集病毒，這需要在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行補(bǔ)充。

綜上所述，本試驗(yàn)建立的雙重PCR方法特異性好，敏感性高，能夠高效的檢測大鼠糞便及組織中的細(xì)小病毒，并且可以用來檢測細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒污染情況，可作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)充方法。

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〔修回日期〕2015-04-20

技術(shù)方法

Development and application of duplex PCR for

detection of H-1 and KRV strains

LI Xiao-bo, FU Rui, WANG Ji, WEI Li, WANG Shu-jing, YUE Bing-fei, HE Zheng-ming

(Laboratory Animal Institute, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

【Abstract】ObjectiveTo develop a duplex PCR assay for detection of rat parvovirus H-1 and KRV and its application. Methods To design specific primers on the basis of H-1(NC001358) and KRV(U790330) genome sequences published in NCBI and establish a duplex PCR assay using H-1 and KRV DNA as templates. To verify the sensitivity and specificity of the method after optimizing PCR. The rats were infected by oral inoculation. The rats were divided into three groups: H-1 infection, KRV infection and mixed infection groups. To collect feces at the 4th, 6th, 8th and 10th days postinfection. Rats were euthanized on the 10th day and samples from heart, liver, spleen, lung, kidney and cecal contents were collected from each rat, then all the samples were screened with the duplex PCR. ResultsThe 183 bp and 302 bp bands were amplified using H-1 and KRV as templates. The sensitivity test showed that the PCR method can detect as low as 3.8 pg/mL H-1 and 0.73 pg/mL KRV. There were no bands amplified when mouse minus virus, canine parvovirus and feline parvovirus were used as templates, showing that the specificity of the duplex PCR assay is very good. The nucleic acids of H-1 or KRV were detected in all rat feces on the 2th day postinfection and there was no obvious clinical symptoms in all the infected rats. The positive rates of H-1 were as follows: 50% (4/8) heart tissues, 50% (4/8) liver tissues, 62.5% (5/8) spleen tissues, 50% (4/8) lung tissues, 37.5% (3/8) kidney tissues and 62.5% (5/8) cecum contents, and the positive rate of single infection group was higher than that of mixed infection group. The positive rates of KRV were as follows: 0 (0/8) heart tissues, 25% (2/8) liver tissues, 87.5% (7/8) spleen tissues, 12.5% (1/8) lung tissues, 25% (2/8) kidney tissues and 62.5%(5/8) cecum contents, and the positive rate of mixed infection group was higher than that of single infection group. ConclusionsThe duplex PCR assay for H-1 and KRV established in this study can effectively detect H-1 or KRV infection in rat feces and other tissues, and can be used as an effective supplement to the national standard of lab animals.

【Key words】Rat parvovirus, RPV; H-1; KRV; Duplex PCR; Rats

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.006.010

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2015) 06-0046-07

[通訊作者]賀爭鳴(1957-)，研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)。E-mail： zhengminghe57@163.com。

[作者簡介]李曉波(1980-)，助理研究員，研究方向: 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué). E-mail： lxb8493059@163.com。

[基金項(xiàng)目]國家科技支撐計(jì)劃“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)測體系的完善與檢測關(guān)鍵技術(shù)研究”(2013BAK11B00)。