尹雪琴，袁　文，王　靜，黃碧洪，饒　丹，伍妙梨，朱余軍，

馮勝鵬，郭鵬舉，張　鈺,黃　韌

(廣東省實驗動物重點實驗室，廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣州　510663)

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實時熒光定量TaqMan-PCR檢測小鼠多瘤病毒方法的建立

尹雪琴，袁文，王靜，黃碧洪，饒丹，伍妙梨，朱余軍，

馮勝鵬，郭鵬舉，張鈺,黃韌

(廣東省實驗動物重點實驗室，廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣州510663)

【摘要】目的建立一種快速、特異、敏感的小鼠多瘤病毒 (murine polyomavirus, MPyV)熒光定量 TaqMan PCR檢測方法，用于MPyV核酸的檢測。 方法根據(jù)GenBank中小鼠多瘤病毒基因組序列設(shè)計了一對特異性引物及TaqMan探針，擴增長度為69 bp的片段，通過優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，對構(gòu)建的重組質(zhì)粒標準品進行檢測，并繪制標準曲線，進行特異性、敏感性和重復(fù)性試驗。最后用建立的方法對人工感染MPyV的肺臟、脾臟和糞便，及86 份小鼠臨床樣本進行檢測，驗證在臨床應(yīng)用中的效果。 結(jié)果 所建立的檢測方法特異性強，只能在小鼠多瘤病毒DNA中檢出熒光信號，檢測靈敏度達到100拷貝，批內(nèi)和批間重復(fù)性好，檢測結(jié)果變異系數(shù)(CV)均小于1.13%，人工感染MPyV小鼠的肺臟、脾臟和糞便均為陽性，對86份臨床樣本進行檢測，有3份樣本呈陽性(陽性率為3.5%)。 結(jié)論 建立的MPyV熒光定量TaqMan-PCR檢測方法特異性強、敏感性高、重復(fù)性好，適合用于MPyV臨床診斷、日常監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查。

【關(guān)鍵詞】小鼠多瘤病毒；實時熒光定量PCR；TaqMan探針

Establishment of a TaqMan real-time fluorescence

小鼠多瘤病毒 (murine polyomavirus, MPyV)屬于多瘤病毒科多瘤病毒屬，為雙鏈DNA病毒，病毒粒子呈圓形，無囊膜，可存在于實驗鼠群和野生鼠群中，為中國實驗動物國家標準《實驗動物微生物等級及監(jiān)測》(GB14922. 2-2011)中SPF級小鼠必要時需排除的病原[1-3]。此外人工感染可使小鼠等動物產(chǎn)生各種組織腫瘤，故MPyV也可用于研究病毒介導(dǎo)的腫瘤機制以及腫瘤模型的建立。然而盡管MPyV具有致腫瘤的特性，但在自然條件下小鼠感染多瘤病毒呈隱形或亞臨床感染[4-6]。在研究病毒介導(dǎo)腫瘤的模型中，小鼠體內(nèi)MPyV含量的變化是分析腫瘤發(fā)展、免疫反應(yīng)及疾病表征的重要指標。故隱性感染一方面可對實驗動物本身造成危害，對科研工作造成潛在干擾，另一方面也可作為研究感染病毒后宿主免疫反應(yīng)的模型。因此建立一個敏感有效的監(jiān)測MPyV感染小鼠的檢測方法，不僅可以保證實驗動物的質(zhì)量，而且有利于建立一個針對病毒、免疫和腫瘤有效的模型系統(tǒng)。本試驗建立了熒光定量定量PCR檢測MPyV的方法，具有敏感性高、特異性強、穩(wěn)定性好、速度快的特點。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1儀器和試劑：熒光定量PCR儀為ABI的7500，常規(guī)PCR儀為購自Biometra的TProfessional Standard Gradient，紫外分光光度計Nanodrop 2000C購自Thermo；PCR Premix、PMD-T19載體、T4連接酶、HotStart Tag酶、dNTPs、MgCl2和DL5000 DNA marker均購自TakaRa公司，病毒DNA抽提試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司。

1.1.2動物、毒株及菌株：小鼠多瘤病毒購自美國典型菌種保藏中心 (ATCC VR-252)，BHK細胞及大腸埃希菌DH-5腸菌株由本實驗室保存，SPF級BALB/c小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心(SCXK(粵)2013-0002)、(SYXK (粵) 2008-0002)。

1.1.3引物和探針：根據(jù)小鼠多瘤病毒基因組序列(GenBank：AF442959.1)，應(yīng)用Oligo7軟件設(shè)計一對特異性引物，擴增產(chǎn)物用于克隆至pMD-T19 載體中，上游引物P1：5′-CCATGGCCTACTT CATTCCG-3′，下游引物P2：5′-CGGTCAACATAGCGCGTCA-3′，該引物擴增的目的片段長度為1603 bp。同時在上述擴增片段內(nèi)設(shè)計一對特異性引物及探針用于熒光定量檢測，上游引物P3：5′-CGGCGTCTCTAAA TGCGAG-3′，下游引物P4：5′-AGCAGTTTGGG AAC GGGTG-3′，TaqMan探針：5′-(FAM)CAAAATGTA CAAAGGCCTGTCCAAGACCC(BHQ-1)-3′，該引物擴增的目的片段長度為69 bp。

1.2方法

1.2.1病毒DNA提?。河贐HK細胞接種小鼠多瘤病毒，48 h后反復(fù)凍融細胞3次收獲病毒，按照病毒DNA抽提試劑盒操作步驟提取病毒DNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2MPyV 基因片段的PCR擴增:PCR反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)液中包括DNA 2 μL，P1、P2上下游引物各1 μL (終濃度為0.4 μM。PCR擴增程序：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性50 s，60℃退火50 s，72℃延伸90 s，共進行35個循環(huán)，72℃延伸10 min，同時設(shè)陰性對照。取PCR擴增產(chǎn)物于經(jīng)溴乙錠預(yù)染的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，5 μL DL 5000 DNA marker作分子量參照，凝膠成像儀下觀察結(jié)果。

1.2.3MPyV標準質(zhì)粒的構(gòu)建:P1、P2擴增的PCR產(chǎn)物(1603 bp)電泳后經(jīng)膠回收試劑盒回收純化后TA克隆連接到pMD-T19載體，并轉(zhuǎn)化至DH-5α感受態(tài)細胞中，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單個菌落，篩選陽性克隆并送立菲生物技術(shù)有限公司測序。擴增陽性克隆菌落，提取重組質(zhì)粒，命名為pMD-T19-MPyV，通過紫外分光光度計測定濃度后，按公式：濃度(拷貝/μL )=[質(zhì)粒濃度(g/ml) × 6.02 × 1023]/[質(zhì)粒大小( bp) × 660]計算初始拷貝數(shù)，重組質(zhì)粒于-20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4熒光定量PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化:以質(zhì)粒pMD-T19- MPyV為模板，用P3、P4及TaqMan探針建立熒光定量PCR檢測方法，按照Premix Ex Tag (probe)試劑盒操作說明配制反應(yīng)體系，分別對引物濃度(0.1～1.0 μmol/L)、探針濃度(0.2～1.0 μmol/L)、退火溫度(55～65)℃、循環(huán)條件(兩步法與三步法)進行條件優(yōu)化，每個條件3個重復(fù)孔，通過比較同一濃度質(zhì)粒的Ct值，熒光強度來判斷最優(yōu)條件。同時設(shè)置BHK細胞DNA為陰性對照，水為空白對照。

1.2.5熒光定量PCR檢測方法特異性分析:使用10種感染小鼠病原的DNA或cDNA為模板進行特異性分析，包括：小鼠巨細胞病毒 (MCMV)、小鼠細小病毒MVM株(MVM)、鼠痘病毒 (ECT)、小鼠腺病毒(MAD)、小鼠腦脊髓炎病毒(TMEV)、呼腸孤病毒III型(Reo3)、仙臺病毒(SV)、小鼠肝炎病毒 (MHV)、小鼠諾如病毒 (MNV)、小家鼠螺桿菌(H.muridarum)，每種病毒2個重復(fù)孔。同時設(shè)立小鼠多瘤病毒DNA為陽性對照，BHK細胞DNA為陰性對照，水為空白對照。

1.2.6熒光定量PCR檢測方法敏感性驗證及線性標準曲線的建立:重組質(zhì)粒pMD-T19-MPyV計算出初始拷貝數(shù)后，用超純水連續(xù)10倍梯度稀釋至濃度在( 1. 0×101)～( 1. 0×107) 拷貝/μL，取2 μL作為熒光定量PCR模板，反應(yīng)體系為1.2.4建立的最優(yōu)條件。

1.2.7實時熒光定量PCR檢測方法的重復(fù)性分析:取3份陽性感染MPyV的BHK細胞 DNA用該方法測定3次；每次試驗每個樣本設(shè)3個重復(fù)孔，計算批內(nèi)、批間差異，從而對本方法檢測的重復(fù)性進行考核。

1.2.8實時熒光定量PCR方法在臨床實際樣本的檢測:

1.2.8.1對人工感染MPyV組織樣本的檢測:人工感染試驗在本實驗室的屏障環(huán)境實驗間[SYXK(粵)2012-0122]進行。用MPyV細胞毒(Ct值為28.33)對1日齡BALB/c小鼠進行0.5 μL滴鼻感染，感染后1周再滴鼻感染10 μL，共感染6只；另設(shè)2只陰性對照小鼠，滴鼻等量滅菌生理鹽水。飼養(yǎng)小鼠至21日齡，斷頸處死后收集肺臟、脾臟和糞便，按照DNA抽提試劑盒操作步驟提取樣本DNA，用本研究建立的熒光 PCR方法分別對6只攻毒鼠與2只陰性小鼠各組織器官樣品進行檢測，每份做3個重復(fù)檢測，觀察擴增曲線。

1.2.8.2對臨床樣品的檢測:用建立的熒光PCR方法對來自廣東省廣州市一家大型實驗鼠場的86份送檢糞便樣品進行了測定，同時設(shè)立陽性對照，觀察各樣品的擴增曲線與Ct值。并用引物對P1/P2 PCR擴增陽性糞便DNA，同時設(shè)立陰性對照，凝膠電泳觀察結(jié)果。

2結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

用引物對P1/P2對構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD-T19-MPyV進行PCR擴增, 得到約1 603 bp長度的片段，與預(yù)期大小一致，且測序鑒定表明與GenBank登記的序列同源性為100%。經(jīng)熒光定量PCR引物對P3/P4擴增出的片段長度約為69 bp，條帶具有特異性，沒有二聚體，結(jié)果見圖1。提取的重組質(zhì)粒濃度為117.7 ng/μL。

注：Marker：DL5000；泳道1為P1/P2對構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD-T19-MPyV進行PCR擴增, 片段約1603 bp；泳道2為P3/P4對構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD-T19-MPyV進行PCR擴增, 片段約69 bp；泳道3為水空白對照。圖1　重組質(zhì)粒pMD-T19-MPyV的PCR鑒定Note.Lane M is 5Kb DNA ladder，lane 1-2 represent PCR results of positive recombinant plasmids using primers P1/P2 and P3/P4, respectively, lane 3 represents blank control.Fig.1　PCR-identified results of the recombinant plasmid pMD-T19-MPyV

2.2 實時熒光定量PCR方法的條件優(yōu)化

以重組質(zhì)粒DNA 為模板，通過對引物濃度(0.1～1.0 μmol/L)、探針濃度(0.2～1.0 μmol/L)、退火溫度(55～65℃)、循環(huán)條件(兩步法與三步法)條件的優(yōu)化，篩選出最佳反應(yīng)體系如下：上、下游引物終濃度0.4 μmol/L，探針終濃度0.8 μmol/L。反應(yīng)程序兩步法為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)。讀板溫度為60℃。

2.3 特異性試驗

對小鼠多瘤病毒及其他非小鼠多瘤病毒的病原DNA或cDNA進行檢測，只有小鼠多瘤病毒DNA出現(xiàn)特異性擴增，在小鼠巨細胞病毒 (MCMV)、小鼠細小病毒MVM株(MVM)、鼠痘病毒 (ECT)、小鼠腺病毒(MAD)、小鼠腦脊髓炎病毒(TMEV)、呼腸孤病毒Ⅲ型(Reo3)、仙臺病毒(SV)、小鼠肝炎病毒 (MHV)、小鼠諾如病毒 (MNV)、小家鼠螺桿菌(H.muridarum)、BHK細胞陰性對照及水空白對照組中無擴增(圖2)。

2.4 敏感性驗證及線性標準曲線的建立

提取的重組質(zhì)粒濃度為117.7 ng/μL，換算成拷貝數(shù)為3.5×1010拷貝/μL，本試驗建立的熒光定量PCR方法以107～101拷貝稀釋度為模板，樣本檢測呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)性為0.999。101拷貝稀釋度起峰較晚，重復(fù)性較其他稀釋度差，故排除，因此本方法判定100個拷貝以上有較好的線性相關(guān)性，Ct值大于33.085為陰性，反之為陽性。圖3為以樣本的拷貝數(shù)為橫軸，檢測的循環(huán)數(shù)為縱軸，建立的標準曲線。

2.5重復(fù)性分析

圖2　MPyV TaqMan-PCR方法特異性試驗結(jié)果Fig.2　Specificity evaluation of the TaqMan-PCR method

注：從左到右依次為102到107拷貝10倍系列稀釋質(zhì)粒標準品；標準曲線定量線性方程：Y=-3.25x + 39.75，R2 =0.999。圖3　熒光定量PCR檢測MPyV DNA的標準曲線Note. Standard curve was obtained with serial dilution of the recombinant plasmid from 102 to 107 copies. The quantitative linear equation of the standard curve: Y=-3.25x + 39.75，R2 =0.999.Fig.3　The standard curve of quantitative fluorescence PCR to detect the DNA of MPyV

用熒光定量PCR對3份不同的陽性細胞毒DNA進行重復(fù)性檢測，每次試驗每個樣本設(shè)3個重復(fù)，并對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析, 做出批內(nèi)批間重復(fù)性評價，結(jié)果表明批內(nèi)檢測變異系數(shù)(CV)均小于0.85%(表1)，批間檢測變異系數(shù)(CV) 均小于1.13%(表2)

表1　陽性樣本批內(nèi)重復(fù)性實驗

表2　陽性樣本批間重復(fù)性實驗

2.6對人工感染MPyV組織樣本的檢測

從21日齡的試驗感染鼠的組織臟器中檢出病毒：6只感染小鼠的肺臟與脾臟的熒光定量 PCR檢測均為強陽性(Ct值在21.10～28.61內(nèi))，且每只小鼠脾臟病毒含量高于肺臟，糞便檢測Ct值在22.24～32.97范圍內(nèi)，2只陰性對照小鼠均為陰性。

2. 7臨床樣品調(diào)查結(jié)果

用本研究建立的熒光定量PCR方法對廣東省廣州市一家大型實驗鼠場抽樣送檢的86份糞便樣品進行了測定，檢出3只小鼠糞便中含有多瘤病毒，引物對P1/P2對此3只糞便DNA進行PCR擴增，凝膠電泳結(jié)果顯示片段大小為1 603 bp左右，與預(yù)期片段大小一致，證實為MPyV陽性。

3討論

MPyV感染對實驗動物本身造成危害，對科研工作造成潛在干擾，且小鼠體內(nèi)MPyV含量的變化是分析腫瘤發(fā)展、免疫反應(yīng)及疾病表征的重要指標，而病毒感染的病理學(xué)研究亦需要一個敏感有效的檢測方法。TaqMan探針熒光定量 PCR技術(shù)具有較高的靈敏度和特異性，操作簡單快速，且后期不需要開蓋處理，大大降低了假陽性的發(fā)生，因其顯著的優(yōu)越性，已被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于臨床診斷[7,8]。我們根據(jù)小鼠多瘤病毒基因組序列(GenBank：AF442959.1)中保守的序列設(shè)計引物和探針建立了實時熒光定量PCR檢測MPyV病毒DNA方法，該方法只能從含有MPyV病毒的樣本中檢測出特異性擴增熒光信號，而不與正常組織及小鼠巨細胞病毒等非MPyV病原DNA發(fā)生交叉反應(yīng)，充分證明了其檢測的高度特異性。

用熒光定量PCR檢測構(gòu)建的pMD-T19-MPyV重組質(zhì)粒標準品，在樣本DNA為107～102拷貝時呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其定量準確性可達到100拷貝，對應(yīng)的Ct值為33.085，即Ct值大于33.085判定為陰性，小于33.085判為陽性。重復(fù)性分析批內(nèi)檢測變異系數(shù)(CV)均小于0.85%，批間檢測變異系數(shù)( CV) 均小于1.13%，說明方法穩(wěn)定可靠。且從樣本核酸提取到報告結(jié)果全程在3小時內(nèi)即可完成。

經(jīng)母體垂直傳播的7日齡幼鼠體內(nèi)唾液腺、腎臟、肝臟和脾臟的病毒量最高[9]，本研究對1日齡BALB/c小鼠滴鼻0.5 μL MPyV病毒液因不確實病毒是否進入小鼠體內(nèi)，故于7日齡進行了第二次滴鼻，21日齡時取肺、脾臟及糞便。本研究未能在不同時間點采取組織樣本以研究MPyV在小鼠體內(nèi)載量的變化規(guī)律，但通過建立的熒光定量PCR檢測結(jié)果可知感染后的小鼠在其21日齡均可檢出MPyV，且脾臟病毒含量高于肺臟，證明MPyV通過鼻腔進入體內(nèi)并在體內(nèi)增殖。同時86個實驗小鼠場的糞便檢查出3份樣品為陽性，說明建立的定量方法能用于人工感染小鼠及臨床樣本的檢測，也為進一步的研究提供了技術(shù)支持。佟巍等曾報道用血清學(xué)方法及普通PCR方法對北京地區(qū)實驗小鼠MPyV感染情況進行初步調(diào)查，結(jié)果表明對實驗動物使用機構(gòu)檢出了MPyV[4]。謝軍芳[10]也建立了小鼠多瘤病毒的血清學(xué)普通PCR檢測方法。上述的血清學(xué)方法及普通PCR方法雖然能檢測小鼠多瘤病毒DNA，但不能定量，而本研究建立的TaqMan探針熒光定量不僅能滿足小鼠多瘤病毒臨床快速診斷檢疫及其分子流行病學(xué)調(diào)查的需要，還能精確定量，敏感度高，報告結(jié)果快，能較好滿足MPyV臨床快速診斷、日常監(jiān)測和分子流行病學(xué)調(diào)查的需要，對實驗動物質(zhì)量檢測具有實際應(yīng)用價值。

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[4]佟巍, 張麗芳, 向志光, 等. 北京地區(qū)2011～2012年度實驗小鼠POLY病毒感染情況調(diào)查與分析 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 23(12): 40-43.

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[10]謝軍芳. TMEV、Ect、LCMV、POLY和PVM病毒免疫血清制備及ELISA等檢測方法的研究 [D]. 碩士學(xué)位論文, 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所, 2009, 45-54.

〔修回日期〕2015-04-09

技術(shù)方法

quantitative PCR for detection of murine polyomavirus

YIN Xue-qin, YUAN Wen, WANG Jing, HUANG Bi-hong, RAO Dan, WU Miao-li,

ZHU Yu-jun, FENG Sheng-peng, GUO Peng-ju, ZHANG Yu, HUANG Ren

(Guangdong Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute,

Guangzhou 510663, China)

【Abstract】ObjectiveTo establish a rapid，specific and sensitive TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR assay for detection of murine polyomavirus (MPyV). Methods The specific primers and TaqMan probe were designed based on genome sequence of MPyV. The primers amplified a 69 bp fragment. After optimizing the reaction system and reaction condition, the standard curve was plotted by detecting recombinant plasmid standards. The specificity, sensitivity and reproducibility of this method were evaluated. In addition, samples of lungs, spleens and feces obtained from experimentally infected mice and 86 clinical samples were used to validate the efficacy of this real-time PCR assay. Results The specificity assay showed that this assay could specifically detect MPyV and the sensitivity for MPyV was about 100 copies/well. The coefficients of variation (CV) of both intra-assay and inter-assay were less than 1.13%. All of the samples from experimentally infected mice were positive for MPyV and 3 out of 86 clinical samples were positive by this TaqMan-PCR detection with a positive rate of 3.5%. ConclusionsThe real-time fluorescence quantitative TaqMan-PCR assay established in this study has high specificity, sensitivity and stability. It can be used for clinical diagnosis, routine detection and epidemiological investigation of murine polyomavirus infections.

【Key words】Murine polyomavirus; Real-time fluorescence quantitative PCR; TaqMan probe; Mice

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.006.011

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 06-0053-06

[通訊作者]黃韌 (1959-)，男，研究員，研究方向: 實驗動物學(xué)和比較醫(yī)學(xué)研究。E- mail: labking@sohu.com。

[作者簡介]尹雪琴 (1988-)，女，實習(xí)研究員，研究方向: 實驗動物病毒學(xué)。E- mail: yinxueqin.dr@163.com。

[基金項目]國家科技支撐計劃 (編號:2013BAK11B01)；廣東省科技計劃項目(編號:2012B010300026)。