孫秀萍，張　楠，高　杰，宋銘晶，秦　川

(1. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，

衛(wèi)生部人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類(lèi)動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室 北京　100021)

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慢性束縛應(yīng)激模型致焦慮和抑郁共病的行為學(xué)研究

孫秀萍，張楠，高杰，宋銘晶，秦川

(1. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，

衛(wèi)生部人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類(lèi)動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室 北京100021)

【摘要】目的建立焦慮抑郁共病動(dòng)物模型，為焦慮抑郁共病的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制及治療方法的研究奠定基礎(chǔ)。方法C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和西酞普蘭組。采用慢性束縛加孤養(yǎng)方法建模，模型組和西酞普蘭組每日束縛4 h(10:00～14:00)，連續(xù)進(jìn)行35 d，單籠飼養(yǎng)。造模14 d后，正常組和模型組給予生理鹽水，西酞普蘭組給予西酞普蘭10 mg/kg，腹腔注射，注射劑量為0.1 mL/10 g，給藥時(shí)間為21 d。應(yīng)用糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)模型抑郁癥狀的轉(zhuǎn)化效度，應(yīng)用空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)模型焦慮癥狀的轉(zhuǎn)化效度，同時(shí)觀察西酞普蘭對(duì)焦慮抑郁模型行為學(xué)改善作用。結(jié)果糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢性束縛模型組糖水偏愛(ài)指數(shù)明顯下降，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，與正常組比較差異具有顯著性(P<0.01，P<0.01)?？?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠在中央?yún)^(qū)停留時(shí)間和運(yùn)動(dòng)路程明顯減少，與正常組比較差異具有顯著性(P<0.01，P<0.05)。西酞普蘭增加模型小鼠的中央?yún)^(qū)時(shí)間及中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)路程(P<0.05，P<0.05)。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組動(dòng)物進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)比例及時(shí)間比例下降，與正常組比較具有顯著性差異(P<0.05，P<0.05)。西酞普蘭未能逆轉(zhuǎn)這種行為學(xué)改變。結(jié)論慢性束縛應(yīng)激模型表現(xiàn)為焦慮抑郁共病，轉(zhuǎn)化效度穩(wěn)定，可作為焦慮抑郁共病動(dòng)物模型，用于焦慮抑郁共病生物學(xué)機(jī)制及其治療研究。

【關(guān)鍵詞】慢性束縛；應(yīng)激；小鼠，焦慮癥，抑郁癥

近年來(lái)，焦慮癥和抑郁癥發(fā)病率不斷攀升。二者雖是相互獨(dú)立的疾病單元，但在臨床上共病發(fā)生率很高，約有一半的抑郁癥患者伴發(fā)焦慮癥[1]。應(yīng)激因素是這兩種精神疾患的重要風(fēng)險(xiǎn)因子，因此應(yīng)激動(dòng)物模型廣泛應(yīng)用于焦慮癥和抑郁癥神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制及其治療策略研究[2]。但目前，尚缺乏轉(zhuǎn)化效度穩(wěn)定的焦慮、抑郁共病應(yīng)激動(dòng)物模型。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，非社會(huì)應(yīng)激因素引起明顯的抑郁癥狀，但焦慮行為表現(xiàn)不穩(wěn)定，而社會(huì)應(yīng)激因素更多產(chǎn)生焦慮行為，所伴發(fā)的抑郁癥狀不穩(wěn)定[3]。建立轉(zhuǎn)化效度更為穩(wěn)定的焦慮抑郁共病動(dòng)物模型，對(duì)臨床焦慮抑郁共病的治療具有重要意義。慢性束縛應(yīng)激，作為非社會(huì)應(yīng)激因素，廣泛應(yīng)用于應(yīng)激相關(guān)疾病的研究[4]。孤養(yǎng)，即將動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，對(duì)于群居動(dòng)物，是一種社會(huì)應(yīng)激因素。本研究復(fù)合非社會(huì)應(yīng)激因素和社會(huì)應(yīng)激因素，采用慢性束縛加孤養(yǎng)應(yīng)激方式，研究小鼠的焦慮和抑郁共病行為，建立穩(wěn)定的焦慮、抑郁共病動(dòng)物模型，為焦慮抑郁共病的病理生理機(jī)制及治療研究奠定基礎(chǔ)。西酞普蘭(citalopram)是選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑，具有抗焦慮和抗抑郁雙重作用。本研究同時(shí)觀察西酞普蘭對(duì)焦慮抑郁共病動(dòng)物模型行為的改善作用。

1材料和方法

1.1動(dòng)物

C57BL/6J雄性小鼠，SPF級(jí)，體重25 g，30只。由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004。動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2014-0029。動(dòng)物自由進(jìn)食進(jìn)水，室內(nèi)溫度：(23～25)℃，相對(duì)濕度：(55±10)%。維持12 h光照/12 h黑暗的晝夜節(jié)律。動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2儀器

動(dòng)物行為學(xué)視頻跟蹤系統(tǒng)(Noldus Information Technology，EthoVision XT，The Netherlands).

1.3實(shí)驗(yàn)方法

動(dòng)物隨機(jī)分為正常組、慢性束縛組、西酞普蘭組，每組10只。模型組和西酞普蘭組動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，慢性束縛方法參照文獻(xiàn)[5]，將動(dòng)物置于50 mL 離心管(離心管上烙制直徑2 mm小孔數(shù)十個(gè)，用于通風(fēng))，每日束縛4 h(10:00～14:00)，連續(xù)進(jìn)行35 d。正常組動(dòng)物5只/籠，不給予任何干預(yù)，放置在另一房間。造模14 d后，正常組和模型組給予生理鹽水，西酞普蘭組給予西酞普蘭10 mg/kg。三組均腹腔注射，注射劑量為0.1 mL/10 g，給藥時(shí)間為21 d。造模結(jié)束，進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.3.1糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn):根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6]，糖水偏愛(ài)測(cè)試方法分為訓(xùn)練期和測(cè)試期。訓(xùn)練期內(nèi)，使動(dòng)物適應(yīng)蔗糖飲水，第1個(gè)24 h，給予動(dòng)物兩瓶1%蔗糖水，第2個(gè)24 h，給予動(dòng)物1瓶1%蔗糖水，1瓶純水。測(cè)試前不禁食禁水，測(cè)試期，同樣給予動(dòng)物1瓶1%蔗糖水，1瓶純水，測(cè)試時(shí)間為15 h。為避免位置偏愛(ài)影響因素，測(cè)試中間，將兩瓶位置互換。測(cè)試結(jié)束，計(jì)算糖水偏愛(ài)指數(shù)(糖水偏愛(ài)指數(shù)=糖水消耗/ 總液體消耗 × 100%)。

1.3.2空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn):方形空?qǐng)霏h(huán)境尺寸為50 cm × 50 cm × 30 cm(長(zhǎng)×寬×高)。中央?yún)^(qū)是以空?qǐng)鲋行狞c(diǎn)為中心，邊長(zhǎng)20 cm的正方形區(qū)域，邊緣區(qū)寬8 cm。將小鼠置于空?qǐng)?，觀察5 min 內(nèi)的自發(fā)活動(dòng)及在中央?yún)^(qū)和邊緣區(qū)的停留時(shí)間。實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)物行為學(xué)視頻跟蹤系統(tǒng)，記錄動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)路程、速度及在各區(qū)的停留時(shí)間等。

1.3.3強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn):動(dòng)物在測(cè)試房間適應(yīng)1 h后，進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。根據(jù)文獻(xiàn)[7]，將小鼠放入高20 cm，直徑12 cm，水深10 cm的圓形玻璃容器中，水溫25℃，觀察6 min，記錄后4 min內(nèi)動(dòng)物的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。判定不動(dòng)的標(biāo)準(zhǔn)是動(dòng)物在水中停止掙扎，呈漂浮狀態(tài)，僅有細(xì)小的肢體運(yùn)動(dòng)以保持頭部浮在水面。

1.3.4高架十字迷宮實(shí)驗(yàn):高架十字迷宮由兩對(duì)相對(duì)開(kāi)臂和兩對(duì)相對(duì)閉壁成十字交叉型組成，開(kāi)壁尺寸為30 cm × 5 cm(長(zhǎng)×寬)，閉臂尺寸為30 cm × 5 cm × 15 cm(長(zhǎng)×寬×高)，中央?yún)^(qū)尺寸為5 × 5 cm，連接四壁。四壁距離地面100 cm。根據(jù)文獻(xiàn)[8]，將動(dòng)物面對(duì)開(kāi)臂方向，放在中央?yún)^(qū)，觀察動(dòng)物在開(kāi)臂和閉臂中的活動(dòng)情況。實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)物行為學(xué)視頻跟蹤系統(tǒng)，記錄動(dòng)物進(jìn)入開(kāi)壁時(shí)間(open arm time，OT)和次數(shù)(open arm entry，OE)，進(jìn)入閉壁的時(shí)間(close arm time，CT)和次數(shù)(close arm entry，CE)。計(jì)算動(dòng)物進(jìn)入開(kāi)壁次數(shù)比例(OE%=OE/(OE + CE) × 100%)以及開(kāi)壁時(shí)間比例(OT%=OT/(OT + CT) × 100%)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1 慢性束縛模型對(duì)小鼠糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)的影響

如圖1所示，慢性束縛模型組糖水偏愛(ài)指數(shù)下降，與正常組比較，差異具有極顯著性(P<0.01)。西酞普蘭提高模型組糖水偏愛(ài)指數(shù)，差異具有顯著性(P<0.05)。

圖1　慢性束縛模型對(duì)糖水偏愛(ài)指數(shù)的影響，與正常組比較；# P<0.05，與模型組比較)Fig.1　Effect of chronic restraint stress on the sucrose preference test in the mice ±s， ** P<0.01, compared with the control group; # P<0.05, compared with the model group)

2.2 慢性束縛模型對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的影響

如圖2所示，慢性束縛模型組強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，與正常組比較，差異具有極顯著性(P<0.01)。西酞普蘭縮短強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，與模型組比較，差異具有顯著性(P<0.05)。

圖2　慢性束縛模型對(duì)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的影響，與正常組比較；# P<0.05，與模型組比較)Fig.2　Effect of forced swim test on the immobility time in the compared with the control group; # P<0.05, compared with the model group)

2.3 慢性束縛模型對(duì)小鼠空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)的影響

如圖3A和3B所示，慢性束縛模型組和正常組小鼠的運(yùn)動(dòng)路程和運(yùn)動(dòng)速度無(wú)顯著性差異，表明慢性束縛的應(yīng)激方式未影響動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)能力。如圖3C所示，模型組小鼠在中央?yún)^(qū)時(shí)間明顯減少，與正常組相比，差異具有極顯著性(P<0.01)；西酞普蘭增加小鼠的中央?yún)^(qū)時(shí)間，與模型組相比，差異具有顯著性(P<0.05)。如圖3D所示，模型組小鼠在中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)路程明顯減少，與正常組相比，具有顯著差異(P<0.05)；西酞普蘭增加小鼠的中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)路程，與模型組相比，具有顯著性差異(P<0.05)。

2.4 慢性束縛模型對(duì)小鼠高架十字迷宮的影響

如圖4A所示，慢性束縛模型減少小鼠進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)比例，與正常組相比，差異具有顯著性(P<0.05)；西酞普蘭組進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)比例增加，但與模型組相比差異無(wú)顯著性(P=0.055)。如圖4B所示，慢性束縛模型減少小鼠進(jìn)入開(kāi)臂時(shí)間比例，與正常組相比，差異具有顯著性(P<0.05)；西酞普蘭組進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)比例增加，但與模型組相比差異無(wú)顯著性。

圖3　慢性束縛模型對(duì)空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)的影響，與正常組比較；# P<0.05，與模型組比較)Fig.3　Effect of chronic restraint stress on open field test in the mice ±s ** P<0.01, compared with the control group; # P<0.05, compared with the model group)

圖4　慢性束縛模型對(duì)高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)的影響±s， * P<0.05，與正常組比較)Fig.4　Effect of chronic restraint stress on elevated plus maze test in the mice ±s， * P<0.05，compared with the control group)

3討論

動(dòng)物模型的轉(zhuǎn)化效度評(píng)價(jià)包括表觀效度(face validity)、預(yù)測(cè)效度(predictive validity)和結(jié)構(gòu)效度(construct validity)三個(gè)層面[9]。表觀效度指動(dòng)物模型中動(dòng)物和人類(lèi)之間癥狀學(xué)的相似性。預(yù)測(cè)效度指治療藥物能有效干預(yù)動(dòng)物模型的相應(yīng)癥狀表現(xiàn)，結(jié)構(gòu)效度指模型與某個(gè)假說(shuō)理論的符合程度。本研究基于應(yīng)激是焦慮癥、抑郁癥等精神疾患的重要風(fēng)險(xiǎn)因子理論，研究了小鼠接受非社會(huì)因素(慢性束縛)和社會(huì)因素(孤養(yǎng))疊加應(yīng)激后的焦慮及抑郁行為表現(xiàn)，并觀察西酞普蘭(具有抗抑郁和抗焦慮雙重作用)對(duì)模型焦慮和抑郁行為的改善作用。因此本研究從表觀效度、預(yù)測(cè)效度和結(jié)構(gòu)效度三個(gè)方面考察了慢性束縛小鼠模型的轉(zhuǎn)化效度。

快感缺失是動(dòng)物抑郁行為最為核心的癥狀之一，嚙齒類(lèi)動(dòng)物快感缺失的定量評(píng)價(jià)方法主要為糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn) (sucrose preference test)[10]。該行為學(xué)評(píng)價(jià)方法基于嚙齒類(lèi)動(dòng)物(主要為大小鼠)喜好糖水的天性, 是目前使用最為廣泛的用于評(píng)價(jià)快感缺失的動(dòng)物行為學(xué)測(cè)試方法。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)35 d的慢性束縛應(yīng)激，模型小鼠的糖水偏愛(ài)指數(shù)明顯下降，與正常組比較差異具有極顯著性。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)是動(dòng)物被迫在一個(gè)局限的空間游泳，首先試圖掙扎逃跑，隨后處于一種間歇性不動(dòng)狀態(tài)，這種狀態(tài)被稱(chēng)為“行為絕望”，與人類(lèi)抑郁癥相似[11]。本研究結(jié)果表明，模型小鼠強(qiáng)迫游泳的不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)。糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示模型小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為。

動(dòng)物焦慮行為學(xué)評(píng)價(jià)方法主要基于動(dòng)物對(duì)新環(huán)境既產(chǎn)生恐懼又產(chǎn)生探究的矛盾心理沖突[12]?？?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)中，中央?yún)^(qū)對(duì)動(dòng)物來(lái)說(shuō)，是未知的威脅情景，焦慮水平高的動(dòng)物由于對(duì)陌生環(huán)境的恐懼，主要在邊緣區(qū)域活動(dòng)，而在中央?yún)^(qū)域活動(dòng)較少[13]。本研究結(jié)果顯示，慢性束縛應(yīng)激模型小鼠在中央?yún)^(qū)的停留時(shí)間及運(yùn)動(dòng)路程明顯減少，提示模型出現(xiàn)焦慮行為。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，由于開(kāi)臂和外界相通，對(duì)動(dòng)物來(lái)說(shuō)具有一定的新奇性同時(shí)又具有一定的威脅性，焦慮水平高的動(dòng)物會(huì)離開(kāi)開(kāi)臂退縮到閉臂中，反之則在開(kāi)臂停留更多的時(shí)間，對(duì)開(kāi)臂的探究次數(shù)也增多。本研究結(jié)果顯示，慢性束縛應(yīng)激模型小鼠進(jìn)入開(kāi)壁的時(shí)間比例和次數(shù)比例均顯著下降，提示產(chǎn)生焦慮行為，與空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，經(jīng)過(guò)35 d的慢性束縛加孤養(yǎng)，小鼠同時(shí)表現(xiàn)出抑郁和焦慮行為，提示慢性束縛應(yīng)激模型具有較好的抑郁焦慮共病表觀效度。

西酞普蘭為選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑，具有抗抑郁和抗焦慮雙重作用[14]。本研究中，西酞普蘭可提高慢性束縛模型的糖水偏愛(ài)指數(shù)，縮短強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，顯示其良好的抗抑郁作用。同時(shí)，西酞普蘭可增加模型小鼠空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)中在中央?yún)^(qū)的停留時(shí)間和運(yùn)動(dòng)路程，顯示其抗焦慮作用。但是，西酞普蘭對(duì)高架十字迷宮中，模型小鼠進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)和時(shí)間比例無(wú)影響，這可能與動(dòng)物在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中的個(gè)體差異較大有關(guān)。西酞普蘭的上述作用提示慢性束縛應(yīng)激模型具有較好的預(yù)測(cè)效度。

綜上所述，慢性束縛應(yīng)激模型表現(xiàn)為焦慮抑郁共病，西酞普蘭可逆轉(zhuǎn)這些行為學(xué)改變。該模型可作為焦慮抑郁共病動(dòng)物模型，用于焦慮抑郁共病神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制及其治療研究。

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〔修回日期〕2015-05-07

研究報(bào)告

Chronic restraint stress produces comobidity behavior of

anxiety and depression disorders in mice

SUN Xiu-ping, ZHANG Nan, GAO Jie, SONG Ming-jing, QIN Chuan

(1.Comparative Medicine Center，Peking Union Medical College (PUMC), and Institute of

Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS); Key Laboratory of

Human Disease Comparative Medicine, Ministry of Health; Key Laboratory of Human

Disease Animal Models, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100021, China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of chronic restraint stress on the comobidity behavior of anxiety and depression disorders in mice. MethodC57BL/6J mice were randomly divided into 3 groups (n=10 per group): control (normal saline), chronic restraint stress (normal saline), and positive control (citalopram, 10 mg/kg). Citalopram and normal saline were administered by intraperitoneal injection. Chronic restraint stress and individual housing was applied to establish the stress model. The mice were individually housed and restrained for 4 h per day in a 50-mL polypropylene conical tube with ventilation holes. This daily restraint was repeated for 35 consecutive days. Sucrose preference test and forced swim test were applied to evaluate the depressive behavior of the mice. Open field test and elevated plus maze test were used to assess the anxiety effect of chronic restraint stress in the mice. ResultsThe sucrose intake was significantly reduced in the chronic restraint stress models compared with the control mice (P<0.01). The immobility time was increased in the forced swim test (P<0.01). The cumulative duration and distance moved in the center were decreased in the open field test(P<0.01，P<0.05). Chronic treatment with citalopram reversed the above mentioned behavior change. The open arm entry and open arm time were decreased in the elevated plus maze test (P<0.05，P<0.05). Citalopram did not reverse this behavior change. ConclusionsMouse models created by chronic restraint and individual housing stress display both anxiety and depressive behavior making them a potent animal model in the treatment of comorbidity of anxiety and depression disorders.

【Key words】chronic restraint; stress; mice; anxiety; depression

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.006.004

【中圖分類(lèi)號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2015) 06-0018-05

[通訊作者]秦川，研究員，E-mail: qinchuan@pumc.edu.cn。

[作者簡(jiǎn)介]孫秀萍(1974-)，女，助理研究員，博士，研究方向：神經(jīng)精神疾病藥理及方法學(xué)。

[基金項(xiàng)目]北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(資助編號(hào)：7142105)。