郎艷松　秘紅英　劉美之　袁國強

(河北醫(yī)科大學，河北　石家莊　050017)

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通心絡聯(lián)合阿托伐他汀、阿司匹林對家兔動脈粥樣硬化早期血管外膜炎癥因子表達的影響

郎艷松1秘紅英1劉美之1袁國強2，3

(河北醫(yī)科大學，河北石家莊050017)

摘要〔〕目的探討“金三角”(ATS)方案即通心絡聯(lián)合阿托伐他汀、阿司匹林對家兔動脈粥樣硬化早期頸動脈外膜炎癥因子表達的影響。方法高脂飲食復合單側頸總動脈硅膠管包裹制備兔動脈粥樣硬化早期模型。72只新西蘭兔隨機分為對照組、模型組、通心絡(TXL)組、阿托伐他汀(ATO)組、阿司匹林(ASP)組和ATS組，每組12只。對照組給予普通飼料、模型組及各用藥組家兔均實施單側頸動脈硅膠管包裹術復合高脂飼料喂養(yǎng)，TXL組給予通心絡超微粉混懸液0.3 g·kg-1·d-1灌胃，ATO組給予阿托伐他汀2.5 mg·kg-1·d-1灌胃，ASP組給予阿司匹林12 mg·kg-1·d-1灌胃，ATS組給予TxL、ATO、ASP三者聯(lián)合，劑量上，灌胃，連續(xù)給藥，4 w后取材，HE染色判定頸動脈內中膜病理形態(tài)變化，生化法檢測血脂變化，ELISA法測定各組家兔頸動脈包裹段外膜單核細胞趨化蛋白(MCP)-1、白介素(IL)-1β、IL-10表達水平，免疫組化法檢測血管外膜IL-8表達水平。結果與對照組比較，模型組總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)表達明顯增強(P<0.01)。與模型組比較，除ASP組外，各用藥組TC、TG、LDL-C表達明顯減弱(P<0.01)。與其他用藥組比較，ATS組TC、TG、LDL-C表達明顯減弱(P<0.01)。與對照組比較，模型組頸動脈外膜中MCP-1、IL-1β表達明顯增強，IL-10表達減弱(均P<0.01)。與模型組比較，各用藥組頸動脈外膜中MCP-1、IL-1β表達減弱(P<0.01)，IL-10表達增強(P<0.05)。與其他用藥組比較，ATS組MCP-1、IL-1β表達明顯減弱，IL-10表達明顯增強(均P<0.01)。各用藥組頸動脈外膜IL-8表達減少。結論TXL、ATO、ASP三藥聯(lián)用可通過降脂、調節(jié)血管外膜炎癥反應從而有效延緩動脈粥樣硬化進程，且較單藥應用作用更佳。

關鍵詞〔〕外膜；炎癥；動脈粥樣硬化；MCP-1；IL-8；IL-10

1河北以嶺醫(yī)藥研究院國家中醫(yī)藥管理局重點研究室(心腦血管絡病)

2河北醫(yī)科大學附屬以嶺醫(yī)院心血管科(國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)絡病學重點學科)

3河北省絡病重點實驗室

第一作者：郎艷松(1988-)，女，碩士，醫(yī)師，主要從事心血管病學研究。

隨著對動脈粥樣硬化(AS)發(fā)病模式研究的不斷深入，“由內而外”的炎癥發(fā)病機制逐漸向“由外而內”轉變。外膜炎癥浸潤程度與AS嚴重程度呈正相關，外膜炎癥細胞分泌多種細胞因子，影響內膜的變化，還可以通過神經(jīng)末梢及直接作用于平滑肌受體影響中膜，促進AS的發(fā)生、發(fā)展〔1〕。在AS早期血管外膜即有MCP-1等的表達，并最終引起炎性細胞聚集在血管壁，進而導致內膜增厚?；趐olypill策略〔2〕，即在固定藥物劑量的基礎上聯(lián)合用藥，減少危險因素的同時未導致不良反應的風險提高，從而控制心血管病危險因素，減少心腦血管的發(fā)病風險。吳以嶺院士提出他汀類藥物聯(lián)合應用阿司匹林及中藥通心絡膠囊，形成有效防治缺血性心腦血管疾病的“金三角”(ATS)優(yōu)選方案。本實驗擬研究該方案對動脈粥樣硬化早期血管外膜炎癥因子表達的影響。

1材料和方法

1.1動物與分組72只雌雄各半的健康新西蘭白兔，體重(1.8±0.2)kg，購自北京富豪實驗動物養(yǎng)殖中心。單籠飼養(yǎng)在河北省絡病重點實驗室。適應性喂養(yǎng)1 w后隨機分為對照組、模型組、通心絡(TXL)組、阿托伐他汀(ATO)組、阿司匹林(ASP)組和ATS組，每組12只。對照組給予普通飼料，其余各組硅膠管包裹后給予高脂飼料(膽固 醇1%，蛋黃粉7.5%，豬油5%，基礎飼料86.5%，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心加工定制)〔3〕。同時根據(jù)人與動物用藥量體表面積計算法，臨灌胃時用0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液將通心絡超微粉、阿托伐他汀和阿司匹林配成相應濃度(所用濃度為臨床等效量)的混懸液，濃度依次為：0.3 g·kg-1·d-1、2.5 mg·kg-1·d-1和12 mg·kg-1·d-1，ATS組灌胃ATO TXL超微粉混懸液加ATO加ASP灌胃，劑量。每日定量給予150 g普通飼料或高脂飼料喂)同時灌胃給藥，自由飲水，連續(xù)喂養(yǎng)4 w。

1.2藥品與試劑ASP超微粉(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號：20120924)、ATO片(輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，批號：1237179)、ASP(石藥集團歐意藥業(yè)有限公司批號：018130311)；羧甲基纖維素鈉(天津永大化學試劑開發(fā)中心，批號：20130418)；總膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(北京九強生物有限公司)、單核細胞趨化因子(MCP)-1、白細胞介素(IL)-10 ELISA試劑盒(美國Cloud-Clone公司 批號：L131226551、L131226557)和考馬斯亮藍染色試劑盒( 南京建成生物工程研究所，批號：20131212)；

1.3主要儀器Sigma-3k15型高速冷凍離心機(Sigma)、日立7080型全自動生化分析儀(Hitachi)、XDTll酶標分析儀(上海迅達醫(yī)療儀器公司)、MDF-U50V型-80℃冰箱(日本SANYO公司)和IF300-150型制冰機(韓國iLshin公司)。

1.4方法

1.4.1硅膠管包裹術自耳緣靜脈注射3%戊巴比妥(1 ml/kg)，將新西蘭白兔仰臥位固定于手術臺上，脫毛后常規(guī)消毒，鋪洞巾。沿其頸部正中線剪開皮膚并逐層鈍性分離，右側頸動脈鞘暴露后，仔細游離出右頸動脈(RCA)約2.5 cm。用準備好的硅膠管縱向切開后包裹于RCA外，滴加青霉素預防感染。術后，縫合傷口，自主蘇醒。術后2次/d、連續(xù)3 d局部消毒，預防感染。

1.4.2樣品采集喂養(yǎng)4 w后，采集前12 h禁食禁水，3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉(1 ml/kg)，腹主動脈取血。嚴格無菌操作，剃毛后消毒，沿頸部正中線剪開，快速分離并取下包管側頸動脈，并一分為二，生理鹽水洗凈，一部分10%中性甲醛溶液保存，另一部分液氮凍存?zhèn)溆?。剩余組織制作石蠟切片做蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.4.3病理標本光鏡觀察取固定標本，脫水、石蠟包埋，切片約4 μm，HE染色，光鏡觀察。

1.4.4血脂測定取全血后，4℃，3 500 r/min離心10 min，取上清液分裝入EP管，采用全自動生化分析儀測定TC、TG、LDL-C水平。

1.4.5炎癥指標測定檢測指標前取出液氮凍存標本，各組動物組織取相同大小，置于預冷的PBS液中，去除管周組織，縱向剖開血管，仔細剝離外膜，吸干稱重。放置于試管中加入生理鹽水，比例為1∶9，制成10%的組織勻漿。3 000 r/min，離心15 min，取上清液待測。嚴格按照酶聯(lián)免疫吸附試劑盒進行操作，酶標儀測吸光度(A)值，根據(jù)標準曲線推算組織勻漿中的濃度?？捡R斯亮藍法進行蛋白定量，計算每克蛋白中MCP-1、IL-1β、IL-10的含量。免疫組化法檢測血管外膜IL-8表達。

1.5統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，采用單因素方差及LSD法檢驗，如方差不齊者用DunnettsT3檢驗。

2結果

2.1各組兔頸動脈光鏡觀察對照組：內皮細胞完整，胞核扁平，與內彈力板貼合緊密，中層平滑肌細胞排列整齊；模型組：內皮細胞有脫落，內膜層明顯增厚,可見少量泡沫狀巨噬細胞形成；各用藥組內膜層部分增厚，但動脈損傷程度減輕，以阿托伐他汀組、通心絡組及ATS組改善更為明顯，見圖1。

2.2血脂與對照組比較，模型組血清TC、TG、LDL-C水平顯著增高(P<0.01)；除ASP組外，各用藥組均有一定降脂作用，與模型組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05)，但ATS組與其他用藥組比較降脂作用更為突出(P<0.01)；其余各用藥組之間兩兩比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.3外膜炎癥指標變化與正常組比較，模型組MCP-1、IL-1β表達明顯增多，IL-10表達減少(P<0.01)；與模型組比較，各用藥組MCP-1、IL-1β表達均減少，IL-10表達增加(P<0.01，P<0.05)；ATS組與其他用藥組分別比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；其余各用藥組之間兩兩比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。與空白組比較，模型組IL-8在血管外膜新生滋養(yǎng)血管處表達增多，與模型組比較，各用藥組外膜新生滋養(yǎng)血管數(shù)量減少(IL-8在微血管內皮細胞陽性表達呈現(xiàn)棕褐色，凡是呈現(xiàn)棕色的并與臨近組織有明顯界限，可視為一個微血管〔4〕)同時IL-8表達減少，見圖2。

圖1　各組頸動脈組織HE染色情況(×400)

圖2　各組頸動脈外膜IL-8表達情況(免疫組化，×400)

組別TCTGLDL-C對照組3.082±0.8460.882±0.2362.59±0.64模型組52.55±11.2821)6.546±1.2931)11.23±0.461)TXL組37.8±6.6973)4)3.65±0.62582)4)5.97±0.442)4)ATO組31.5±7.1922)4)3.392±0.7822)4)5.12±0.372)4)ASP組49.43±3.7975.286±1.610.93±0.52ATS組23.7±0.8282)2.035±0.2932)4.1±0.242)

與對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05；與ATS組比較：4)P<0.01；下表同

表2　各組頸動脈外膜MCP-1、IL-1β、IL-10

3討論

新西蘭白兔是制備動脈粥樣硬化模型的常用動物之一〔5〕，本研究聯(lián)合“頸動脈硅膠管包裹+高脂喂養(yǎng)”在較短時間內制備AS早期模型〔6〕，結果顯示4 w模型組AS程度與人類AS早期征象-血管壁內膜層增厚，脂紋形成的病理改變相似〔7〕。

動脈外膜炎癥是誘發(fā)AS發(fā)生的早期事件之一〔8〕。已有研究表明血管外膜炎癥的出現(xiàn)先于AS病理形態(tài)學改變〔9〕，在AS形成時，腹主動脈外膜有大量淋巴細胞和巨噬細胞浸潤〔10〕，外膜浸潤的炎性細胞除B淋巴細胞、T淋巴細胞、單核-巨噬細胞外還有肥大細胞〔11〕，浸潤程度與AS嚴重程度相對應，這些炎性細胞又可分泌IL-1、IL-8、MCP-1等細胞因子〔12〕。

在AS早期，MCP-1基因即表達，此外受到TNF-α、IL-1、干擾素等的刺激誘導時，MCP-1基因均會明顯增加〔13〕，隨后出現(xiàn)分泌大量MCP-1的巨噬細胞〔14〕，而MCP-1與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關。高脂等干預引起血流機械力的改變誘導血管內皮細胞和平滑肌細胞生成MCP-1〔15〕，吸引滋養(yǎng)血管內的單核細胞經(jīng)血管壁游出并聚集到動脈外膜進而成為巨噬細胞后又釋放大量的MCP-1，引起單核細胞遷移進入內膜下，大量炎癥細胞在血管內膜聚集，進而導致動脈內膜層增厚，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展〔16〕。他汀類藥物、阿司匹林、通心絡均能通過不同機制發(fā)揮其抗炎作用〔17～19〕，本結果證實各用藥組能夠明顯減少血管外膜MCP-1表達，ATS組作用更為突出。

MCP-1還能夠誘導單核細胞自身合成,過程由IL-10調節(jié)〔20〕，IL-10作為參與AS的單一的抑炎因子，可抑制多種炎癥因子的表達，同時能抑制單核細胞對內皮細胞的黏附，在AS進程中起保護作用。本結果提示各用藥組均能通過增加IL-10的表達發(fā)揮保護作用，ATS組效果優(yōu)于三藥單用。

炎癥反應發(fā)生時IL-8基因在血管內皮細胞大量表達，因此在血管外膜可見在滋養(yǎng)血管周圍IL-8呈現(xiàn)黃褐色表達，IL-8和MCP-1作用相似，能促使單核細胞在內皮細胞上的滾動轉變成強有力的黏附，同時IL-8也能夠促進內皮細胞和平滑肌細胞的增殖和遷移，在AS中發(fā)揮著重要作用〔21〕。外膜上的IL-1β能夠誘導炎癥細胞在外膜的聚集，進而導致內皮細胞和平滑肌細胞增殖。實驗中各用藥組能夠減少IL-8和IL-1β減少內皮細胞增殖和遷移，其中三藥聯(lián)用組優(yōu)于三藥單用組。以往的臨床和基礎實驗已證實ATS方案在降脂、穩(wěn)定斑塊方面作用明顯〔22〕，效果優(yōu)于三藥單用〔22〕。

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〔2014-12-09修回〕

(編輯李相軍)

Effects of Tongxinluo combined with atorvastatin and aspirin on the adventitia inflammation in the early stage of atherosclerosis

LANG Yan-Song,MI Hong-Ying，LIU Mei-Zhi,etal.

Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,Hebei,China

【Abstract】ObjectiveTo discuss the effect of Tongxinluo combined with atorvastatin(ATO) and aspirin(ASP) on the adventitia inflammation of early atherosclerosis lesions in rabbits.MethodsSeventy-two New Zealand rabbits were randomly divided into control，model，tongxinluo(TXL)，ATO，ASP,golden triangle(Tongxinluo combined with ATO and ASP,ATS) groups(n=12).All the groups were fed with medicine for 4 weeks.The tissue slice of carotid artery was stained by HE and observed under light microscope.The changes of blood liquid were detected by biochemical assay.ELISA was used to measure the carotid artery adventitia of MCP-1,IL-1β,IL-10.The immunohistochemical staining was used to detect the protein expression of IL-8 around the carotid artery adventitia .ResultsCompared with those of normal group，the contents of TC,TG,LDL-C were significantly increased(P<0.01)，the content of IL-10 was significantly decreased(P0．05).In ATS group，the contents of TC，TG,LDL-C were lower than those in ATO and TXL groups(P<0.01).Compared with those of normal group，the contents of MCP-1,IL-1β were significantly increased(P<0.01)，the content of IL-10 was significantly decreased(P<0.01)in model group． Compared with those of model group，the contents of MCP-1,IL-1βwere decreased(P<0.01)in TXL,ATO and ASP groups，but no significant differences between the three groups( P>0.05).The content of IL-10 was decreased(P<0.01,P<0.05)in ATS group，the contents of TC，TG,LDL-C were lower than those in TXL,ATO and ASP groups(P<0.01).The content of IL-8 was decreased in TXL,ATO,ASP and ATS groups.ConclusionsThe ATS project could enhance the effect of regulating lipid metabolism and inhibiting the adventitia inflammation .It played an important role to intervene in the process of atherosclerosis.

【Key words】Adventitia;Inflammation；Atherosclerosis;MCP-1;IL-8;IL-10

通訊作者：袁國強(1977-)，男，主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事心血管病學研究。

基金項目：國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(No.2012CB518606)

中圖分類號〔〕R543〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6008-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.003