張驚宇　張力娜　鄭永慧　初婷婷　葉琳琳　趙　虹　楊子超

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江　哈爾濱　150081)

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體外原代培養(yǎng)腦膠質(zhì)瘤細胞對化療藥物敏感性的影響

張驚宇張力娜鄭永慧初婷婷葉琳琳趙虹楊子超

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江哈爾濱150081)

摘要〔〕目的建立離體膠質(zhì)瘤組織原代培養(yǎng)細胞，測試其對常用抗癌化療藥物的敏感性。方法手術(shù)切除54例人腦惡性膠質(zhì)瘤，取3級星形細胞瘤在培養(yǎng)皿中進行原代培養(yǎng)，采用八肽膽囊收縮素(CCK-8)法檢測惡性腦膠質(zhì)瘤細胞對順鉑(DDP)、長春新堿(VCR)、替尼泊甙(VM-26)、替莫唑胺(TMZ)、尼莫司汀(ACNU)的體外敏感性。結(jié)果對原代培養(yǎng)腫瘤細胞進行藥物敏感性試驗，敏感率依次為VM-26>TMZ>ACNU>DDP>VCR(P<0.05)。結(jié)論用CCK-8法進行化療藥物的敏感性測定可以更好地輔助臨床化療和放療，避免盲目使用藥物。

關(guān)鍵詞〔〕腦膠質(zhì)瘤細胞；八肽膽囊收縮素

第一作者：張驚宇(1979-)，女，博士后，主要從事腦血管病的診斷及治療的研究。

腫瘤干細胞(CSCs)對腫瘤細胞的存活、增殖凋亡和轉(zhuǎn)移以及復發(fā)有著重要影響。腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移侵襲又依賴于其自身運動和遷徙能力。目前，人急性髓性白血病中已成功分離出腫CSCs〔1〕，而且發(fā)現(xiàn)CSCs對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移機制以及相應的治療具有重要意義。腦膠質(zhì)瘤是常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤〔2～4〕。高級別的腦膠質(zhì)瘤細胞具有強烈的侵襲性〔5〕，表現(xiàn)為急速的細胞分裂增生，并且伴隨著新生血管生成。本研究通過進行腦膠質(zhì)瘤細胞的原代培養(yǎng)，探究幾種常見化療藥物在膠質(zhì)瘤綜合治療方法中的效果。

1材料與方法

1.1主要材料及試劑標本均取自吉林大學第一醫(yī)院手術(shù)切除的新鮮腦膠質(zhì)瘤標本。5-氟尿嘧啶(上海生工)，胎牛血清(Thermo)，八肽膽囊收縮素(CCK-8)試劑盒(天津百瑩公司)，含5%小牛血清的RPMI培養(yǎng)基(Gibco公司)，胰蛋白酶、注射用青霉素G鈉、鏈霉素、二甲基亞砜(國藥試劑)。5%CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國)；DYF-880倒置熒光相差顯微鏡(Olympus，日本)；SM600自動酶標儀(UTRAO)；生物安全柜(BSC-1200A2，香港力康)；96孔細胞培養(yǎng)板(Amresco，美國)。

1.2化療藥物尼莫司汀(ACNU)、順鉑(DDP)、長春新堿(VCR)、替尼泊甙(VM-26)、替莫唑胺(TMZ)。其原液的血漿峰濃度(PPC)分別為0.99、0.53、3.50、5.99、3.67 μg/ml。5種藥物均以此為基點，用生理鹽水稀釋成5種不同濃度，PPC按公式Log(PPC)=-0.788+(0.755×Log LD50)〔6〕。見表1。

1.3方法

1.3.1膠質(zhì)瘤細胞的原代培養(yǎng)及純化傳代手術(shù)切下無菌腫瘤標本，迅速放入冰盒中并送到實驗室細胞房中。打開生物安全柜，將新鮮的腫瘤標本用含青霉素和鏈霉素、不含血清的培養(yǎng)液進行反復沖洗，直至腫瘤細胞清洗干凈并且沒有雜質(zhì)。接著將腫瘤細胞切成小塊組織，移至離心管中混勻離心，加入2 ml提前37°C預熱好的胰蛋白酶消化2 min，放在37℃培養(yǎng)箱中震蕩1 h，離心機800 r/min，5 min后吸去上清液，在離心管中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，用吸管吸打、重懸、離心、反復重懸，用移液槍吸取200 μl重懸的腫瘤細胞懸液于96孔板中，混勻后放入細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，48 h后換液，倒掉原有的培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3遍，再加入不含血清的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，反復進行換液培養(yǎng)孵育，最后置入5%CO2、37℃恒溫、保濕細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)待用。

1.3.2CCK-8法檢測取100 μl腫瘤細胞懸液于96孔板中，并放在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h(37℃、5%CO2)。每孔中加入10 μl不同濃度的各種抗腫瘤藥物并均設(shè)3個重復，同時設(shè)置對照組，在恒溫細胞培養(yǎng)箱中孵育24、48、72 h，將CCK-8溶液進行預熱，然后向每個孔中加入CCK-8溶液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h后用酶標儀(選擇450 nm波長)檢測OD值，取3孔OD值的平均數(shù)，根據(jù)下列公式計算細胞生長抑制率(IR)=(1-實驗組OD值/無藥組OD值)× 100%，IR在50%以上認為對該藥敏感, IR<50%歸入耐藥。

1.4統(tǒng)計學方法應用SPSS17.0軟件行χ2或校正χ2檢驗。

2結(jié)果

2.1腦膠質(zhì)瘤原代細胞培養(yǎng)結(jié)果54例腦膠質(zhì)瘤標本，32例培養(yǎng)成功，藥敏實驗價率為89.3%。24 h時腫瘤細胞生長良好，形態(tài)正常，以后梭形細胞逐漸增多；48 h后腫瘤細胞形態(tài)發(fā)生變化，梭形較多；72 h后可見星形細胞明顯突起，呈不規(guī)則及放射狀，細胞體積增大。見圖1。

圖1　倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細胞形態(tài)

2.2各種化療藥物對腦膠質(zhì)瘤細胞的IR對54例惡性腦膠質(zhì)瘤標本進行原代細胞培養(yǎng)，22例培養(yǎng)失敗。培養(yǎng)成功的32例標本中膠質(zhì)瘤Ⅲ級20例，Ⅳ級12例(男6例，女6例)。以抗腫瘤藥物在血漿峰濃度(PPC)觀察培養(yǎng)成功的32例標本的抑制情況，敏感率從大到小依次為：VM-26(12例，37.5%)>TMZ(11例，34.4%)>ACNU(8例，25.0%)>DDP(7例，21.9%)>VCR(6例，18.8%)(χ2=32.4，P<0.05)。耐藥

率ACNU15例(46.9%)，TMZ18例(56.3%)，DDP10例(31.3%)，VM-26 9例(28.1%)，VCR17例(53.1%)。

3討論

目前，腦膠質(zhì)瘤尤其是惡性腦膠質(zhì)瘤仍然是無法完全治愈的疾病。有研究顯示，腦膠質(zhì)瘤最佳手術(shù)時間≤15個月，并且僅26.5%的病人經(jīng)過診斷后能夠生存2年〔6〕。治療以手術(shù)切除為主，并輔以各種化療藥物抑制腫瘤細胞的生長，以此減輕病人的痛苦。所以，研究化療藥物對腫瘤細胞的敏感性變得尤為重要。由于涉及倫理方面的考慮，不能直接以患者個體為臨床實驗對象，只能夠利用最接近個體腫瘤細胞形狀的原代培養(yǎng)方法，對腫瘤細胞進行培養(yǎng)，模擬出與人腦中生長的腦膠質(zhì)瘤細胞相近的細胞進行藥敏研究。

原代培養(yǎng)過程中最需要注意的就是污染問題，需嚴格注意培養(yǎng)時的無菌操作，任何步驟都應在生物安全柜中進行；在對組織進行處理時，需要剔除掉那些壞死的組織，保持組織的相對純凈，并且取得的組織最好是未經(jīng)放療和化療的，否則會影響細胞原代培養(yǎng)的成功。人腦膠質(zhì)瘤標本中除膠質(zhì)瘤細胞外,尚含一定量的腦膠質(zhì)細胞、成纖維細胞、血細胞、腦膜內(nèi)皮細胞等雜質(zhì)細胞〔7〕。將組織切成很小的組織塊，這樣更有利于培養(yǎng)。本文中培養(yǎng)細胞時未采用單細胞培養(yǎng)的方法，導致細胞之間相互作用，故導致一些細胞原代培養(yǎng)失敗。

本文采用的5種化療藥物都是如今已用于臨床上的藥物，但由于每個病人的個體性質(zhì)不同，所以對不同病人施用不同種類和濃度的藥物都會產(chǎn)生差異性。本研究結(jié)果表明惡性腦膠質(zhì)瘤對VM-26、TMZ相對敏感，同時也發(fā)現(xiàn)存在對VM-26、TMZ不敏感的個體。故在惡性腦膠質(zhì)瘤化療前做體外藥敏試驗，選擇對不同個體敏感的化療藥物進行個體化化療非常必要。

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〔2015-03-17修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者：楊子超(1950-)，男，主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事腦梗死的溶栓治療及溶栓后神經(jīng)功能維護的研究。

基金項目：黑龍江省自然科學基金面上項目(No.p01423)；黑龍江省教育廳科學技術(shù)項目(No.12531257)；哈爾濱市科技局青年后備人才項目(No.2013RFQYJ062)

中圖分類號〔〕R73〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6023-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.009