謝家和　謝東明　廖祥中　朱金海　張古老

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)二科,江西　贛州　341000)

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AngⅡ上調(diào)Th17/白細(xì)胞介素-17表達(dá)對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響

謝家和謝東明廖祥中朱金海張古老

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)二科,江西贛州341000)

摘要〔〕目的觀察Th17/白細(xì)胞介素(IL)-17對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響。方法通過(guò)導(dǎo)管球囊損傷動(dòng)脈血管加高脂飼養(yǎng)的方法建立兔動(dòng)脈粥樣硬化模型。22只新西蘭大白兔隨機(jī)分為正常對(duì)照組、高脂組、貝那普利組。飼養(yǎng)12 w后，檢查兔動(dòng)脈粥樣斑塊的大小、血脂水平、血漿血管緊張素(Ang)Ⅱ、IL-17、超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平。結(jié)果成功建立起兔動(dòng)脈粥樣硬化模型；高脂組、貝那普利組總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)及血漿AngⅡ、IL-17、hs-CRP表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)；貝那普利組血漿AngⅡ、IL-17、hs-CRP表達(dá)水平明顯低于高脂組(P<0.05)，血脂水平(TC、LDL-C、VLDL-C)表達(dá)沒有差異(P>0.05)，血漿AngⅡ與IL-17水平呈正相關(guān)(P<0.05)，血漿IL-17與hs-CRP水平呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論AngⅡ會(huì)促使動(dòng)脈粥樣硬化的形成，其一個(gè)機(jī)制可能為AngⅡ上調(diào)Th17/ IL-17表達(dá)， Th17/ IL-17可能通過(guò)引起和加劇機(jī)體炎癥反應(yīng)參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。

關(guān)鍵詞〔〕血管緊張素(Ang)Ⅱ；動(dòng)脈粥樣硬化；Th17/白細(xì)胞介素(IL)-17；超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)

第一作者：謝家和(1985-)，男,住院醫(yī)師,主要從事動(dòng)脈粥樣硬化研究。

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是心腦血管疾病中最常見的疾病，嚴(yán)重危害人類尤其是老年人的健康，其導(dǎo)致心臟缺血、心肌梗死、腦卒中等心腦血管疾病的發(fā)生〔1〕。研究報(bào)道，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)在AS發(fā)生、發(fā)展中有重要作用〔2,3〕，對(duì)AngⅡ?qū)е翧S的發(fā)生確切機(jī)制尚未完全闡明。最近有研究報(bào)道，Th17/白細(xì)胞介素(IL)-17功能的異常與AS發(fā)生密切相關(guān)，但其對(duì)AS具體影響有一定爭(zhēng)議〔4,5〕，本文擬觀察Th17/IL-17在AS的表達(dá)及其是否介導(dǎo)AngⅡ參與AS的形成。

1材料和方法

1.1主要試劑AngⅡ放射免疫分析試劑盒購(gòu)于北方生物技術(shù)研究所，貝那普利(北京諾華制藥有限公司)購(gòu)于贛州市華爾康大藥房，IL-17、超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)于生工生物工程有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料新西蘭雄性大白兔，體重(2.0±0.2)kg，3～4月兔齡，購(gòu)于贛州畜牧研究所，合格證號(hào)：0000236；普通飼料購(gòu)于贛州畜牧研究所，高脂飼料購(gòu)于北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司。

1.3兔AS模型新西蘭大白兔在適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后行導(dǎo)管球囊(導(dǎo)管球囊來(lái)源于醫(yī)院廢棄導(dǎo)管球囊經(jīng)消毒處理)損傷兔左側(cè)頸總動(dòng)脈，具體操作參考文獻(xiàn)〔6〕介紹的方法同時(shí)給予高脂飼料飼養(yǎng)，高脂飼料配方參照于麗娜等〔7〕介紹的方法：1%膽固醇+5%豬油+10%蛋黃粉+84%普通飼料。飼養(yǎng)滿12 w后用超聲探查左側(cè)頸總動(dòng)脈斑塊是否形成判斷模型成功與否的標(biāo)志。

1.4實(shí)驗(yàn)分組、飼養(yǎng)與給藥22只兔隨機(jī)分正常對(duì)照組6只，造模兔16只；造模兔行導(dǎo)管球囊損傷左側(cè)頸總動(dòng)脈后，隨機(jī)分為高脂組，貝那普利組。①正常對(duì)照組，每只兔飼養(yǎng)普通飼料100 g/d，早晚各50 g。②高脂組，每只兔飼養(yǎng)高脂飼料100 g/d，早晚各50 g，并定時(shí)按2 mg ·kg-1·d-1行生理鹽水灌胃。③貝那普利組，每只兔飼養(yǎng)高脂飼料100 g/d，早晚各50 g，并定時(shí)按2 mg ·kg-1·d-1行貝那普利灌胃。

1.5造模成功后實(shí)驗(yàn)兔的血漿、血清及組織的提取兔AS模型成功后，禁食不禁水24 h后，通過(guò)空氣栓塞處死兔，取右心房血裝入抗凝管、促凝管及AngⅡ?qū)Ｓ霉埽?0 min內(nèi)離心，保存于-80℃冰箱用于做相關(guān)檢測(cè)，解剖兔主動(dòng)脈、左頸動(dòng)脈等組織、清洗后，保存于-80℃冰箱做相關(guān)檢測(cè)。血脂水平由我院檢驗(yàn)科幫助完成；取兔主動(dòng)脈粥樣硬化組織常規(guī)固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片的厚度約5 μm，做常規(guī)HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組兔動(dòng)脈組織HE切片形態(tài)變化；血漿AngⅡ的檢測(cè)嚴(yán)格按照放射免疫分析試劑盒說(shuō)明書操作步驟；血漿IL-17、hs-CRP的檢測(cè)嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作步驟。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0軟件行t檢驗(yàn)、單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用線性回歸相關(guān)性分析。

2結(jié)果

2.1各組實(shí)驗(yàn)兔主動(dòng)脈內(nèi)膜組織肉眼觀及HE病理切片觀察正常對(duì)照組兔主動(dòng)脈內(nèi)膜肉眼觀為內(nèi)膜光滑、平整、沒有油脂狀物質(zhì)增生；高脂組兔主動(dòng)脈內(nèi)膜肉眼觀為內(nèi)膜可見一層油脂狀物質(zhì)，表面凹凸不平，突出管腔明顯；貝那普利組兔主動(dòng)脈內(nèi)膜肉眼觀為內(nèi)膜可見一層油脂狀物質(zhì)，表面凹凸不平，突出管腔，較高脂組比較，病變程度減輕。見圖1。正常對(duì)照組兔主動(dòng)脈病理切片為內(nèi)膜光滑，平整，無(wú)泡沫細(xì)胞；高脂組兔主動(dòng)脈病理切片為內(nèi)膜增生明顯，大量泡沫細(xì)胞堆積，膠原、鈣化及脂質(zhì)沉積，斑塊破裂；貝那普利組兔主動(dòng)脈病理切片為內(nèi)膜增生明顯，膠原沉積、鈣化及脂質(zhì)沉積，與高脂組比較，病變程度減輕。見圖2。

2.2血脂水平飼養(yǎng)12 w后檢測(cè)各組兔的血脂水平總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)，正常對(duì)照組、高脂組、貝那普利組血脂水平差異顯著(P<0.05)；高脂組和貝那普利組與正常對(duì)照組之間差異顯著(P<0.05)，見表1。

2.3血漿AngⅡ水平的表達(dá)正常對(duì)照組、高脂組、貝那普利組血漿AngⅡ差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；見表1。

2.4血漿IL-17水平的表達(dá)正常對(duì)照組、高脂組、貝那普利組間血漿IL-17差異均顯著(P<0.05)，見表1。

2.5血漿hs-CRP水平的表達(dá)正常對(duì)照組、高脂組、貝那普利組之間血漿hs-CRP水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見表1。

2.6血漿AngⅡ水平與IL-17水平的相關(guān)性血漿AngⅡ水平與IL-17水平呈正相關(guān)(r=0.79，P<0.05)。見圖3。

2.7血漿IL-17水平與hs-CRP水平相關(guān)性血漿IL-17水平與hs-CRP水平呈正相關(guān)(r=0.74,P<0.05)，見圖4。

圖1　各組兔主動(dòng)脈內(nèi)膜大體標(biāo)本

圖2　各組兔主動(dòng)脈內(nèi)膜病理學(xué)觀察(HE，×200)

組別nTC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)VLDL-C(mmol/L)AngⅡ(pg/ml)IL-17(pg/ml)hs-CRP(pg/ml)正常對(duì)照組61.29±0.711.16±0.680.51±0.150.65±0.500.67±0.161238.32±125.6096.99±28.290.96±0.42高脂組829.1±1.861)5.89±5.911.19±2.6619.0±1.031)8.02±2.781)1554.38±32.231)221.50±36.541)21.91±5.021)貝那普利組828.7±1.501)6.64±5.692.42±2.4516.7±4.371)6.93±2.911)2)1419.76±32.781)157.05±41.681)2)13.23±4.021)2)

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.05，與高脂組比較：2)P<0.05

圖3　血漿AngⅡ水平與IL-17水平相關(guān)性

圖4　血漿IL-17水平與hs-CRP水平相關(guān)性

3討論

Th17細(xì)胞是在研究自身免疫性疾病過(guò)程中逐漸被發(fā)現(xiàn)的一類新的效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞亞群，Th17細(xì)胞在IL-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-B、IL-21、IL-23等因子作用下由初始CD4+T細(xì)胞分化而來(lái)〔8,9〕。Th17能夠分泌IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、 IL-17F、IL-22以及腫瘤壞死因子(TNF)-α等細(xì)胞因子，以分泌IL-17為特征，通常說(shuō)IL-17一般指IL-17A，維甲酸相關(guān)核孤兒受體tγ(ROR-γt)是Th17細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子，是控制Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子。Th17細(xì)胞的功能主要體現(xiàn)在分泌因子IL-17上,IL-17的功能研究主要集中在IL-17A，其他的亞型研究很少〔10,11〕。IL-17是一個(gè)前炎性因子，其主要效應(yīng)細(xì)胞為表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，Th17/IL-17可能會(huì)促使AS形成。國(guó)外有報(bào)道，在AS ApoE(-/-)小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)其動(dòng)脈斑塊IL-17、 ROR-γt的mRNA水平與對(duì)照組有明顯升高，且Th17細(xì)胞增加的水平與斑塊的大小成正相關(guān)，中和性抗體IL-17Ab能減輕其斑塊的發(fā)展，并使斑塊更加穩(wěn)定〔12〕。在急性冠脈綜合征患者的外周血中Th17比例，IL-17的蛋白和 mRNA 水平都比健康對(duì)照組有明顯升高〔13〕。也有一些研究得出不一致的研究結(jié)果，有研究認(rèn)為Th17/IL-17就有抗AS作用，Taleb等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)小鼠中(SOCS-3)細(xì)胞因子3信號(hào)抑制物的失活增加了IL-17A和IL-10的產(chǎn)生，減少了自身免疫反應(yīng)表型的巨噬細(xì)胞，進(jìn)而減輕了炎癥反應(yīng)及減少了斑塊的形成。導(dǎo)致各個(gè)研究之間差異的原因很多，可能與采血時(shí)間、試劑的廠家及使用方法等不同有關(guān)，而研究者也指出，IL-17 家族因子的作用可能依賴疾病所處的階段和是否處于活動(dòng)期等因素有密切的關(guān)系〔15〕。目前有研究認(rèn)為，Th17/IL-17可能通過(guò)NF-κB、MAPK信號(hào)途徑誘導(dǎo)下游IL-6、hs-CRP等炎性因子表達(dá)升高，參與AS的形成。IL-17 能通過(guò)NF-κB信號(hào)激活支氣管上皮細(xì)胞分泌IL-6、hs-CRP、CXCL-1,-2,-3,-5等炎性、趨化因子，引起和加劇機(jī)體炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生〔16〕。大量研究發(fā)現(xiàn) IL-6、hs-CRP是AS形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，促使和加快AS形成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高脂組hs-CRP水平最高，其次貝那普利組，正常對(duì)照組最低，通過(guò)對(duì)hs-CRP與IL-17相關(guān)性分析，hs-CRP與IL-17呈明顯正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此推測(cè)Th17/IL-17促動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制可能與增加hs-CRP等炎性物質(zhì)表達(dá)有關(guān)。

AngⅡ與Th17/IL-17之間有密切關(guān)系，最近有研究報(bào)道，AngⅡ可以上調(diào)Th17/IL-17(一類新的效應(yīng)性CD4+細(xì)胞亞群及其分泌因子)表達(dá)，給予不同劑量AngⅡ刺激健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞后，Th17細(xì)胞比例上升，培養(yǎng)細(xì)胞ROR-γt mRNA(維甲酸相關(guān)核孤兒受體tγ,是控制Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子) 表達(dá)增加，上清液IL-17水平顯著升高，且呈濃度依賴性〔17〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高脂組AngⅡ、IL-17水平最高，其次貝那普利組，正常對(duì)照組最低。通過(guò)對(duì)AngⅡ與IL-17相對(duì)比值相關(guān)性分析，結(jié)果表明IL-17水平與AngⅡ水平相對(duì)比值成正相關(guān)。因此，本文推測(cè)AngⅡ可能通過(guò)上調(diào)Th17/IL-17表達(dá)引起IL-6、hs-CRP等炎性因子升高，參與AS的形成。這些研究結(jié)果對(duì)預(yù)防AS，防止其發(fā)生與發(fā)展，對(duì)防治心腦血管等疾病有一定意義。

參考文獻(xiàn)4

1李玉林.病理學(xué)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008:113-6.

2Fukui K,Yamada H,Matsubara H,etal.Pathophysiological role of tissue renin-angiotensin aldosterone system (RAAS) in human atherosclerosis 〔J〕.Nihon Rinsho,2012;70(9):1556-61.

3Hirata Y,Fukuda D,Sata M.Critical role of rennin-angiotensin system in the pathogenesis of atherosclerosis〔J〕.Nihon Rinsho,2011;69(1):55-9.

4Soraya Taleb,Alain Tedgui Ziad Mallat.Interleukin-17:friend or foe in atherosclerosis 〔J〕.Curr Opin Lipidol,2010;21(5):404-8.

5Dart ML,Jankowska-Gan E,Greenspan S,etal.Interleukin-17-dependent autoimmunity to collagen type V in atherosclerosis〔J〕.Circ Res,2010;107(9):1106-16.

6Da Cunha V,Tham DM,Martin-McNuhy B,etal.Enalapfl attenuates angiotensin Ⅱ-induced atherosclerosis and vascular inflammation〔J〕.Atherosclerosis,2005;178(1)：9-17.

7于麗娜,徐延敏,趙輝.氯沙坦對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化炎癥因子的影響〔J〕.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2010;18(6):377-8.

8Soraya Taleb,Alain Tedgui,Ziad Mallat.Adaptive T cell immune responses and atherogenesis〔J〕.Curr Opin Pharmacol，2010;21(2):197-202.

9Korn T,Bet E,Gao W,etal.IL-21 initiates an alternative pathway to in duce proinflammatory T(H) 17 cells〔J〕.Nature,2007;448(7152):484-7.

10Park H,Li Z,Yang XO,etal.A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17〔J〕.Nat Immunol,2005;6(6):1133-41.

11Harrington LE,Hatton RD,Mangan PR,etal.Interleukin17-producing CD4 effector T cells develop via a lineage distinct from the T heper type 1 and 2 lineages〔J〕.Nat Immunol,2005;6(11):1123-32.

12Gao Q,Jiang Y,Zhang L,etal.A critical function of Th17 pro-inflammatory cells in the development of atherosclerotic plaque in mice〔J〕.Immunol,2010;5(10):5820-7.

13Wang Z,Lee J,Zheng Q,etal.Increased Th17 cells in coronary artery disease are associated with neutrophilic inflammation〔J〕.Scand Cardiovasc,2011;45(6):54-61.

14Taleb S,Romain M,Ramkhelawon B,etal.Loss of SOCS3 expression in T cells reveals a regulatory role for interleukin-17 in atherosclerosis〔J〕.Exp Med,2009;206(10):2067-77.

15De Boer OJ,van der Meer JJ,Teeling P,etal.Differential expression of interleukin17 family cytokines in intact and complicated human atherosclerotic laques〔J〕.J Pathol,2010;220(4):499-508.

16Huang F,Kao CY,Wachi S,etal.Requirement for both JAK-mediated PI3K signaling and ACT1/TRAF6/TAK1-dependent NF-kappaB activation by IL-17A in enhancing cytokine expression in human airway epithelial cells 〔J〕.Immunology,2007;179(10):6504-13.

17吉慶偉.高血壓合并頸動(dòng)脈粥樣硬化患者效應(yīng)性T細(xì)胞活性和血管緊張素Ⅱ水平研究〔D〕.武漢：華中科技大學(xué),2010.

〔2014-09-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

通訊作者：謝東明(1969-)，男，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)脈粥樣硬化研究。

基金項(xiàng)目：江西省科技廳項(xiàng)目(No.20133097)

中圖分類號(hào)〔〕R544.1〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)21-6030-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.012