張武德　程衛(wèi)東　鮑英存　趙　敏

(蘭州大學第二醫(yī)院中醫(yī)科，甘肅　蘭州　730030)

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扶正抑瘤湯對肝癌Hu-7細胞誘導凋亡及自噬的作用

張武德程衛(wèi)東1鮑英存趙敏

(蘭州大學第二醫(yī)院中醫(yī)科，甘肅蘭州730030)

摘要〔〕目的探討扶正抑瘤湯對裸鼠移植瘤肝癌Hu-7細胞的誘導凋亡及自噬的調(diào)控作用。方法50只裸鼠分為五組，即模型組，扶正抑瘤湯高(按人小鼠等效劑量換算為0.3 g生藥/25 g小鼠)、中(高劑量組稀釋1倍)、低劑量組(中劑量組稀釋1倍)，5-氟尿嘧啶(5-Fu)組，每組10只，建立人肝癌細胞Hu-7移植瘤裸鼠模型，待腫瘤體積長到約100 mm3時開始用藥，扶正抑瘤湯灌胃給藥(1次/d)，5-Fu組(2次/d)和模型組采用腹腔注射(1次/d)，給藥3 w，于停藥第2天各組處死裸鼠，剝離腫瘤稱重，繪制腫瘤生長曲線，計算抑瘤率；留取腫瘤組織，TUNEL染色檢測扶正抑瘤湯對移植瘤細胞凋亡的作用；透射電鏡(TEM)檢測自噬體形成情況，Western印跡檢測自噬相關(guān)蛋白(Beclin-1、Bnip3及LC3)表達變化。結(jié)果與模型組比較，5-Fu組與扶正抑瘤湯組均能誘導細胞凋亡，減緩瘤體生長速度，抑制腫瘤生長率以高劑量藥物組效果最佳，與5-Fu組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，扶正抑瘤湯組和5-Fu組染色后熒光顯微鏡下均可見著色凋亡細胞，且隨著藥物組濃度變化，呈劑量相關(guān)性，其中高劑量組誘導細胞凋亡作用最顯著。電鏡結(jié)果顯示：扶正抑瘤湯高劑量組和5-Fu組均可見到大量自噬小體，自噬小體數(shù)量與藥物濃度呈劑量相關(guān)性，其中高劑量組藥物自噬小體數(shù)量較中、低劑量組多，模型組亦發(fā)現(xiàn)少量自噬小體；Western印跡檢測結(jié)果顯示：與模型組比較，扶正抑瘤湯各劑量組和5-Fu組均可使自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、Bnip3及LC3表達上調(diào)，且與藥物濃度有劑量相關(guān)性，其中高劑量藥物組較中、小劑量組更優(yōu)。結(jié)論扶正抑瘤湯對裸鼠肝癌轉(zhuǎn)移瘤Hu-7具有抑制腫瘤細胞生長，誘導腫瘤細胞凋亡的作用，并且可激活肝癌細胞Beclin-1、Bnip3及LC3蛋白的表達，從而誘導腫瘤細胞發(fā)生自噬，其中以高劑量組效果最佳。

關(guān)鍵詞〔〕扶正抑瘤湯；肝癌；裸鼠；凋亡；自噬

1蘭州大學中西醫(yī)結(jié)合研究所

第一作者：張武德(1970-)，男，主任醫(yī)師，博士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合研究。

中醫(yī)認為，腫瘤為人體正虛邪客聚于體內(nèi)所致。因此腫瘤在機體內(nèi)的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后，與人體正氣、邪氣的強弱有關(guān)，因此，腫瘤的治療與預(yù)后，取決于人體內(nèi)部正邪雙方斗爭的結(jié)果。中藥具有補充人體正氣、提高機體免疫力的良好作用，同時還具有殺傷腫瘤細胞、阻滯細胞周期等抗腫瘤效應(yīng)。扶正抑瘤湯由紅芪、當歸、莪術(shù)、墓頭回四味藥組成。當歸、紅芪為補氣補血扶正的要藥、也是甘肅地道藥材，具有良好的補養(yǎng)人體正氣，提高機體的免疫功能作用〔1,2〕。莪術(shù)、墓頭回具有活血化瘀、清熱解毒等祛邪作用，對腫瘤細胞的生存產(chǎn)生抑制作用〔3,4〕。本實驗從誘導腫瘤發(fā)生凋亡和自噬兩個方面探討扶正抑瘤湯的抗腫瘤作用。

1材料與方法

1.1實驗藥物試驗用藥材均購于蘭州市藥材市場，經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學藺海明教授鑒定。紅芪、當歸、莪術(shù)、墓頭回按3∶1∶1∶3的比例組方，常規(guī)煎藥，然后將藥物濃縮至2 g生藥/ml，4℃保存?zhèn)溆?。注射?-氟尿嘧啶(5-FU)，天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)，15～25℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗動物與瘤株BALB/C-nu裸鼠50只，6～8周齡，體重18～22 g，SPF級，雌雄各半，在SPF級屏蔽系統(tǒng)輔以潔凈層流柜環(huán)境中飼養(yǎng)。由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格號：SKXK(甘)201106-0014。人肝癌細胞株Hu-7由蘭州大學第二醫(yī)院消化腫瘤研究所提供，由蘭州大學第二醫(yī)院中心實驗室傳代凍存。

1.3試劑TUNEL染色試劑盒(美國Sigma公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(恒星生物工程有限公司)；胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)；Triton-100寶信生物有限公司；抗體均購自Promag；BeyoECL Plus購自碧云天等。

1.4儀器CO2細胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；680型酶聯(lián)儀(美國BIO-RAD公司)；XL型流式細胞儀(美國貝克曼COULTER公司)；JY92-2D超聲波細胞破碎機(寧波新芝公司)，震動切片機Leika TV1000；熒光顯微鏡Olympus X51；彩色成像系統(tǒng)Olypus DP72；恒溫箱：上海智誠 ZGP-A2050等。

1.5方法

1.5.1模型的分組及處理取對數(shù)生長期的Hu-7細胞，收集并調(diào)整細胞濃度至1×108個/ml，每只裸鼠以0.2 ml接種右腋下，所有動物接種在30 min內(nèi)完成。待腫瘤體積約在100 mm3時，移植瘤模型建立完成。

1.5.2動物分組及給藥根據(jù)模型小鼠性別分層，按腫瘤體積大小隨機分為模型組，5-Fu組，扶正抑瘤湯高(3 g生藥/25 g小鼠)、中(高劑量組稀釋1倍)、低劑量組(中劑量組稀釋1倍)，模型組每日腹腔注射0.9%生理鹽水0.2 ml，5-Fu組每周腹腔注射兩次5-Fu，劑量為17 mg·d-1·kg-1。每日固定時間治療，連續(xù)21 d。

1.5.3藥物對移植瘤的抗肝癌效應(yīng)檢測 試驗期間動態(tài)觀察腫瘤生長情況，每3天用游標卡尺測量腫瘤最大長徑和短徑，按公式計算每組動物的腫瘤體積。用藥結(jié)束2 d后，處死小鼠，取瘤稱重，計算每組的腫瘤生長抑制率。

1.5.4藥物誘導移植瘤細胞凋亡的檢測(TUNEL染色檢測)移植瘤標本經(jīng)甲醛溶液固定48 h，石蠟包埋，4 μm切片，TUNEL染色后顯微鏡下觀察腫瘤組織凋亡情況。

1.5.5透射電鏡觀察瘤組織細胞的自噬小體將瘤組織剝離黃豆大小固定于3%的戊二醛，樣品用1%鋨酸固定，丙酮逐級脫水，Epon 812 包埋放置過夜，半薄切片光學定位，超薄(70 nm)切片，鈾、鉛染色，電鏡下觀察瘤組織細胞中的自噬小體。

1.5.6自噬相關(guān)蛋白的檢測 將切取的各組新鮮瘤塊組織充分研磨，過濾后提取腫瘤組織總蛋白，采用Western印跡檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、Bnip3及LC3的表達變化(結(jié)果用Image J軟件分析)。

1.6統(tǒng)計學方法使用SPSS15.0統(tǒng)計軟件行方差分析。

2結(jié)果

2.1各劑量組水煎液及5-Fu組對裸鼠移植瘤的抑制作用

2.1.1腫瘤生長曲線與對照組相比，藥物組和5-Fu組均能抑制腫瘤的生長，且隨藥物濃度的升高呈劑量相關(guān)性，其中以高劑量組和5-Fu組效果最佳(P<0.05)。見圖1。

2.1.2各組藥物對移植瘤生長的抑制作用模型組裸鼠瘤體生長最快，5-Fu組和扶正抑瘤組均能抑制腫瘤的生長，高劑量組抑制腫瘤生長最顯著，與5-Fu組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見表1。

2.2TUNEL染色檢測各劑量組及5-Fu組誘導裸鼠移植瘤細胞凋亡的作用各組均可見到凋亡后被染色的細胞，但其中對照組和扶正抑瘤湯低劑量組凋亡細胞最多，5-Fu組凋亡細胞最少，高劑量組次之。見圖2。

圖1　各組對裸鼠移植瘤生長的影響

組別平均瘤重(g)抑瘤率(%)模型組6.22505-Fu組3.151)49.391)扶正抑瘤高劑量組4.001)35.741)扶正抑瘤中劑量組4.851)22.081)扶正抑瘤低劑量組5.721)8.11)

與5-Fu組比較：1)P<0.05

圖2　熒光顯微鏡下TUNEL染色后的各組瘤細胞(熒光顯微鏡下,×40)

2.3電鏡觀察自噬小體的形成扶正抑瘤各劑量組及對照組均可見雙層膜包裹的自噬體，其中5-Fu組和扶正抑瘤高劑量組可見較多散在雙層膜的自噬體，扶正抑瘤中、低劑量組中及對照組可見少量自噬體。見圖3。

圖3　電子顯微鏡下觀察各組瘤細胞自噬小體(×40)

2.4Westen 印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、Bnip3及LC3的表達變化5-Fu組和扶正抑瘤高劑量組能顯著上調(diào)蛋白的表達水平(P<0.01)，扶正抑瘤中、低劑量組作用不明顯。見圖4，表2。

1.模型組；2:5-Fu組；3:扶正抑瘤湯高劑量組；4:扶正抑瘤湯中劑量組；5:扶正抑瘤湯低劑量組圖4　Western印跡檢測自噬相關(guān)蛋白表達

指標模型組5-Fu組扶正抑瘤高劑量組扶正抑瘤中劑量組扶正抑瘤低劑量組LC318231)221)2)182)162)Beclin-14281)241)2)151)2)52)Bnip313371)311)2)251)2)132)

與模型組比較：1)P<0.01；與5-Fu組比較：2)P<0.01

3討論

肝癌是世界范圍高發(fā)的惡性腫瘤，目前對肝癌的治療仍沒有較好的療效，長期生存率仍然很低。因此，從中藥入手尋找抗癌藥物成為近年的研究熱點。扶正抑瘤湯是趙建雄教授的臨床經(jīng)典方，臨床及實驗證明其具有明顯的抗腫瘤功效〔5,6〕，但具體的作用機制不甚明了。本文以裸鼠肝癌移植瘤為研究對象，初步探討了扶正抑瘤湯的抗腫瘤作用。

自噬被稱為2型程序性死亡，是真核細胞內(nèi)的一種溶酶體依賴性的高效亞細胞降解途徑。研究證實，自噬廣泛存在于真核細胞的病理和生理過程中，是一種高度保守的細胞行為，與細胞的生長、增殖，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程有密切的聯(lián)系。隨著自噬的進一步研究，發(fā)現(xiàn)多種蛋白的表達與自噬有關(guān)，Beclin-1基因在大多人類乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中都有等位基因缺陷〔7〕，該種蛋白基因缺失與調(diào)節(jié)自噬和調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的信號通路有著緊密的聯(lián)系。人類與小鼠的體外研究已經(jīng)證實自噬是抑制腫瘤發(fā)生的機制之一。研究發(fā)現(xiàn)Beclin-1雜合子缺失的小鼠發(fā)生自發(fā)性肝細胞癌的頻率較高〔8〕，和正常肝臟細胞系相比，肝癌細胞中許多自噬基因(Atg5、Atg7 和Beclin-1)的表達和它們相關(guān)的自噬活性均減弱。試驗證明，肝癌患者體內(nèi)Beclin-1 mRNA和蛋白在肝癌細胞組織中的水平比鄰近非腫瘤組織更低〔9〕。同時，侵襲性高的肝癌HCC細胞系和病情反復發(fā)作的HCC 組織比侵襲性弱的細胞系或組織自噬水平更低〔9〕。

Bnip3是Bcl-2家族中Bp-only亞家族的成員，在Bcl-2家族中。Bnip3屬于促凋亡蛋白，主要通過促進線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔開放和線粒體的損傷來誘導凋亡。另外，Bnip3可通過與Bcl-2及Bcl-XL形成異構(gòu)體，拮抗其抗凋亡作用〔10〕，也可增強Bax和Bak的促凋亡作用，并可誘導自體吞噬〔11〕。

自噬體膜標志性蛋白LC3是哺乳動物中酵母Atg8 基因的同源物，是細胞自噬膜的通用標記物，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面。研究認為LC3是一種比較特異的自噬診斷相關(guān)指標。通過構(gòu)建LC3與綠色熒光蛋白的融合蛋白，通過熒光顯微鏡科觀察到LC3 在細胞中的具體定位。細胞中新合成的LC3經(jīng)過加工，成為胞質(zhì)可溶性LC3-Ⅰ，后者經(jīng)泛素樣加工修飾，與自噬泡膜表面的PE結(jié)合，稱為LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ的含量在某種程度上反映了細胞的自噬活性。在營養(yǎng)豐富時LC3-Ⅱ的信號有時比LC3-Ⅰ更強；在免疫印跡實驗中也更敏感〔12〕。

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〔2013-06-25修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者：程衛(wèi)東(1963-)，男，教授，博士后，博士生導師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合研究。

基金項目：中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(lzujbky-2011-106)

中圖分類號〔〕R735.7〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6036-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.014