葛麗麗,樸軍顏,楊小昂#， 尹艷慧，張　毓

1)鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院 鄭州 450052　2)鄭州市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450053　3)北京大學(xué)免疫學(xué)系T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室 北京 100083

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沉默F(xiàn)ATE/BJ-HCC-2基因的表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響*

葛麗麗1,2),樸軍顏1),楊小昂1)#， 尹艷慧3)，張毓3)

1)鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院 鄭州 4500522)鄭州市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 4500533)北京大學(xué)免疫學(xué)系T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室 北京 100083

關(guān)鍵詞FATE/BJ-HCC-2；RNA干擾；肝癌；轉(zhuǎn)移

摘要目的：研究FATE/BJ-HCC-2基因表達(dá)與肝癌細(xì)胞遷移及侵襲的關(guān)系。方法：體外合成FATE/BJ-HCC-2基因序列特異性小干擾RNA(siRNA)，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系克隆株5B4，并設(shè)非特異性siRNA轉(zhuǎn)染和空白對(duì)照組。采用RT-PCR及Western blot方法檢測各組細(xì)胞中 FATE/BJ-HCC-2 mRNA和蛋白的表達(dá)；通過Transwell小室模型檢測各組細(xì)胞體外遷移及侵襲的能力；激光共聚焦顯微鏡下觀察5B4及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞(Mock)的骨架結(jié)構(gòu)。結(jié)果：各組細(xì)胞中FATE/BJ-HCC-2 mRNA和蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.321，P=0.020)，特異性siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞低于其他2組(P<0.05)。抑制FATE/BJ-HCC-2基因表達(dá)后，細(xì)胞體外遷移及侵襲的能力降低(F=6.171和10.109，P<0.05)。5B4細(xì)胞形態(tài)拉長，蝌蚪狀，呈現(xiàn)遷移、游走的狀態(tài)；微絲豐富，形態(tài)規(guī)則，平行貫穿于細(xì)胞全長，細(xì)胞膜周圍有較多絲狀偽足伸出；微管減少，分布不規(guī)則。結(jié)論：FATE/BJ-HCC-2基因表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移及侵襲。

AbstractAim: To study the effects of FATE/BJ-HCC-2 gene expression on the migration and invasion of hepatocellular carcinoma(HCC) cells.Methods: The HCC cell clone line 5B4 cells was transfected with FATE/BJ-HCC-2 gene sequence-specific small interference RNA(siRNA) synthesised in vitro.The expressions of FATE/BJ-HCC-2 mRNA and protein were detected by RT-PCR and Western blot,respectively.The migration and invasion ability of cells were examined by Transwell assay. The cytoskeleton of 5B4 cells transfected FATE/BJ-HCC-2 and empty vector control(Mock) cells was observed by laser scanning confocal microscope.The 5B4 cells not treated were used as blank control.Results: Both of mRNA and protein expressions declined in the group of cells transfected with FATE/BJ-HCC-2 sequence-specific siRNA(F=15.321，P=0.020). The migration and invasion ability of 5B4 cells obviously reduced after FATE/BJ-HCC-2 gene was silenced (F=6.171 and 10.109，P<0.05). Compared with that of the mock cells, the morphological and cytoskeleton structure of 5B4 cells transfected with FATE/BJ-HCC-2 changed obviously. Conclusion: FATE/BJ-HCC-2 gene expression promotes migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells.

腫瘤-睪丸抗原是一類具有特異性表達(dá)模式的腫瘤相關(guān)抗原。正常情況下，腫瘤-睪丸抗原僅在睪丸的生殖細(xì)胞如精子、卵子和胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤-睪丸抗原在黑色素瘤等多種腫瘤組織中高表達(dá)，與腫瘤形成、腫瘤細(xì)胞凋亡、腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移等有密切關(guān)系，且能引起細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，是目前臨床腫瘤免疫治療中最具有應(yīng)用前景的一類腫瘤相關(guān)抗原。FATE/BJ-HCC-2是最近發(fā)現(xiàn)的新的腫瘤-睪丸抗原基因。該基因位于染色體Xq28，全長7 000 bp，共編碼含183個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)[1]。在國際腫瘤-睪丸抗原分類中，F(xiàn)ATE/BJ-HCC-2基因被命名為FATE/CT43[2]。作者前期的研究結(jié)果顯示，F(xiàn)ATE/BJ-HCC-2 mRNA在肝癌組織中高表達(dá)，并與肝癌細(xì)胞的增殖以及肝癌組織的分化程度密切相關(guān)。該研究通過體外化學(xué)合成FATE/BJ-HCC-2序列特異性小干擾RNA(small interference,siRNA)，抑制肝癌細(xì)胞中FATE/BJ-HCC-2基因的表達(dá)，采用Transwell小室模型檢測細(xì)胞遷移及侵襲能力的改變，并在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞骨架的變化，進(jìn)一步探討FATE/BJ-HCC-2 基因表達(dá)水平的變化對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響。

1材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑穩(wěn)定表達(dá)FATE/BJ-HCC-2的人肝癌細(xì)胞系7402的單克隆細(xì)胞株5B4和空載體轉(zhuǎn)染的Mock細(xì)胞由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室建立并保存。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000 為Invitrogen 公司產(chǎn)品；抗-FATE/BJ-HCC-2多抗由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室制備保存；羊抗兔HRP IgG抗體購自Zymed公司(北京中杉生物技術(shù)公司分裝)；DAB顯色劑購自北京中杉生物技術(shù)公司；總RNA提取試劑Trizol購自Gibco-BRL公司。dsRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)5B4細(xì)胞和Mock細(xì)胞均生長于DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前1 d接種于6孔板，待細(xì)胞生長至50%～60%融合時(shí)，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。

1.3siRNA合成與細(xì)胞轉(zhuǎn)染根據(jù)GenBank 中FATE/BJ-HCC-2的序列，參考siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)FATE/BJ-HCC-2基因的siRNA。FATE/BJ-HCC-2特異性siRNA的正義鏈序列：5’-CCAAACGAGUU UGGAAUAUTT-3’,反義鏈序列：5’-AUAUUCCA AACUCGUUUGGTT-3’。為檢測siRNA的轉(zhuǎn)染效率，合成帶熒光標(biāo)記的非特異性siRNA，正義鏈序列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUCT-3’，反義鏈序列：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。250 μL無血清DMEM中加入20 μmol/L dsRNA 8 μL，室溫孵育5 min；另在250 μL無血清DMEM中加入LipofectamineTM2000 5 μL，室溫孵育5 min。將上述兩種溶液混勻，室溫孵育20 min,加入6孔板中，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞。

1.4RT-PCR檢測細(xì)胞中FATE/BJ-HCC-2 mRNA表達(dá)取轉(zhuǎn)染48 h后的5B4細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測RNA的濃度和純度。取2 μg總RNA加入反轉(zhuǎn)錄酶處理，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。內(nèi)參GAPDH上游引物：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。FATE/BJ-HCC-2上游引物：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，共30個(gè)循環(huán);72 ℃ 延伸5 min。用2-ΔCT表示目的基因的表達(dá)量。

1.5Western blot檢測FATE/BJ-HCC-2蛋白表達(dá)取轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，用1×SDS裂解，提取細(xì)胞總蛋白。每個(gè)樣品上樣50 μg, 經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。10 g/L BSA 4 ℃封閉過夜，加入FATE/BJ-HCC-2抗體(稀釋5 000倍)，室溫孵育2 h，TBST漂洗3次，加入HRP標(biāo)記的二抗(稀釋1 000倍)，4 ℃孵育1 h，TBST漂洗3次后顯影。

1.6細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn) 將含有趨化因子的無血清DMEM培養(yǎng)基按每孔600 μL加入Transwell實(shí)驗(yàn)小室的底層，小心蓋上孔徑8 μm的聚碳酯膜。將消化好的空白對(duì)照(未作轉(zhuǎn)染)細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)組(特異性轉(zhuǎn)染組為轉(zhuǎn)染了FATE/BJ-HCC-2 siRNA的5B4細(xì)胞；非特異性轉(zhuǎn)染組為轉(zhuǎn)染了非特異性siRNA的5B4細(xì)胞)細(xì)胞按每孔2×105個(gè)加入上層小室，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后，吸棄上層小室培養(yǎng)基，用PBS濕潤的棉球小心擦去聚碳酯膜上面的細(xì)胞，取出聚碳酯膜，膜下面附著的即是遷移的細(xì)胞。將遷移的細(xì)胞用甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色20 min。每張聚碳酯膜隨機(jī)選擇5個(gè)視野，10倍鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞。將50 μg ECM鋪在直徑8 μm的聚碳酯膜上，將細(xì)胞按每孔2×105個(gè)加入上層小室，培養(yǎng)10 h后，按照上述方法處理后計(jì)數(shù)侵襲到小室背面的細(xì)胞數(shù)。

1.7免疫熒光激光共聚焦實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的5B4和Mock細(xì)胞，接種于6孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)板中預(yù)先植入高壓滅菌的蓋玻片，常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出蓋玻片，PBS沖洗3次。40 g/L多聚甲醛室溫固定30 min, PBS沖洗3次，Triton X-100 通透15 min, PBS沖洗3次，用10 g/L的BSA室溫封閉1 h。將羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽和FITC標(biāo)記的β-tublin分別加入細(xì)胞中，室溫孵育1 h。PBS沖洗3次，加入hoechst33342避光染色30 min。PBS沖洗、瀝干，置于潔凈無熒光載玻片上，于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0 進(jìn)行分析，各組細(xì)胞FATE/BJ-HCC-2 mRNA的表達(dá)和體外遷移及侵襲能力的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.15B4和Mock細(xì)胞中FATE/BJ-HCC-2基因的表達(dá)見圖1。

5B4細(xì)胞FATE/BJ-HCC-2 mRNA表達(dá)(1.000±0.102)高于Mock細(xì)胞(0.026±0.028)(t=17.600，P=0.003)。5B4細(xì)胞FATE/BJ-HCC-2蛋白表達(dá)高于Mock細(xì)胞。

2.2轉(zhuǎn)染后，各組細(xì)胞中FATE/BJ-HCC-2基因的表達(dá)FATE/BJ -HCC-2 mRNA的表達(dá)見表1，蛋白的表達(dá)見圖2。

表1　各組細(xì)胞FATE/BJ-HCC-2 mRNA的表達(dá)

F=15.321,P=0.020；*：與空白對(duì)照組和非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組比較，P<0.05。

圖2　各組細(xì)胞FATE/BJ-HCC-2蛋白的表達(dá)

1：空白對(duì)照組；2：非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組；3：特異性siRNA轉(zhuǎn)染組。

2.3各組細(xì)胞體外遷移及侵襲能力比較結(jié)果見表3。

表3　各組細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力比較　個(gè)

*：與空白對(duì)照組和非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組比較，P<0.05。

2.4細(xì)胞形態(tài)改變的觀察免疫熒光共聚焦顯微鏡下(圖3)可見，Mock細(xì)胞多呈不規(guī)則狀，形態(tài)較圓潤，易相連成片生長；微絲稀疏、紊亂；胞質(zhì)內(nèi)顯示豐富的微管組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，由細(xì)胞中心呈放射狀伸展到細(xì)胞邊緣，核周呈現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光。5B4細(xì)胞形態(tài)拉長，蝌蚪狀，呈現(xiàn)遷移、游走的狀態(tài)；微絲豐富，形態(tài)規(guī)則，平行貫穿于細(xì)胞全長，細(xì)胞膜周圍有較多絲狀偽足伸出；微管減少，分布不規(guī)則，熒光弱。

圖3　細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞骨架觀察(標(biāo)準(zhǔn)尺=50 μm)

3討論

作者前期研究[3-5]顯示，F(xiàn)ATE/BJ-HCC-2基因的表達(dá)與肝癌細(xì)胞的增殖呈正相關(guān)，而在肝癌組織中FATE/BJ-HCC-2蛋白的表達(dá)頻率為20%；部分患者外周血FATE/BJ-HCC-2 mRNA呈陽性表達(dá)。因此推測，F(xiàn)ATE/BJ-HCC-2 可能在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。為進(jìn)一步探索FATE/BJ-HCC-2的生物學(xué)功能，作者采用能夠穩(wěn)定表達(dá)FATE/BJ-HCC-2基因的肝癌細(xì)胞株5B4細(xì)胞，觀察FATE/BJ-HCC-2基因表達(dá)變化后細(xì)胞形態(tài)的改變及該基因被沉默后肝癌細(xì)胞體外遷移和侵襲能力的變化。

腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力是其在體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的體現(xiàn)。腫瘤細(xì)胞中存在多種促癌基因和抑癌基因，它們功能失調(diào)或者缺失從而導(dǎo)致腫瘤的形成、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移[6-7]。惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的形成過程包括侵襲、內(nèi)滲、外滲和轉(zhuǎn)移4個(gè)部分。當(dāng)腫瘤細(xì)胞失去細(xì)胞之間的黏附后,就會(huì)離開原發(fā)灶,滲入內(nèi)皮血管進(jìn)入體循環(huán)，最后定居于遠(yuǎn)端位點(diǎn)從而完成腫瘤的轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是影響患者生活質(zhì)量和死亡的主要原因，因此，探索腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制是拯救腫瘤患者的關(guān)鍵所在。近來研究[8]發(fā)現(xiàn)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelia-l mesenchymal transitions,EMT)這一現(xiàn)象與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要組織屏障。該研究結(jié)果顯示，干擾FATE/BJ-HCC-2基因表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯降低，提示FATE/BJ-HCC-2基因的表達(dá)與肝癌細(xì)胞的遷移及侵襲有密切聯(lián)系。

腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移與其運(yùn)動(dòng)能力密不可分，而細(xì)胞的有效運(yùn)動(dòng)一方面來自于細(xì)胞內(nèi)、外的細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞骨架動(dòng)力裝置所給予的原動(dòng)力，另一方面則是骨架成分介導(dǎo)的黏附作用所提供的錨定力，兩者之間相互協(xié)調(diào)才能完成細(xì)胞的移動(dòng)[9]。細(xì)胞骨架是由細(xì)胞中細(xì)纖維網(wǎng)狀物質(zhì)組成的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，直接影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能[10]。在細(xì)胞遷移過程中，細(xì)胞骨架前端伸出片狀或絲狀偽足，通過與細(xì)胞外基質(zhì)建立新的黏附來維持伸展?fàn)顟B(tài)；然后，細(xì)胞借助肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白來調(diào)節(jié)細(xì)胞體收縮，從而使細(xì)胞不斷向前運(yùn)動(dòng)；最后，細(xì)胞的尾部與基質(zhì)部分分離，細(xì)胞回縮。由此可見，細(xì)胞的有效運(yùn)動(dòng)是腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的關(guān)鍵步驟[11-13]。因此，細(xì)胞骨架在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲中起著非常重要的作用。該研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了FATE/BJ-HCC-2基因的肝癌細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞形態(tài)變得細(xì)長，蝌蚪狀，周圍有偽足，呈現(xiàn)遷移、游走的狀態(tài)。可見，F(xiàn)ATE/BJ-HCC-2基因表達(dá)能夠改變肝癌細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，從而對(duì)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移能力具有一定的作用。

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*國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目321400531010

Effects of silencing FATE/BJ-HCC-2 gene on migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells

GELili1,2),PIAOJunyan1),YANGXiaoang1),YINYanhui3),ZHANGYu3)

1)AcademyofMedicalandPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)ClinicalLaboratory,ZhengzhouChildren′sHospital,Zhengzhou4500533)DepartmentofImmunology,HealthSciencesCenter,PekingUniversity，Beijing100083

Key wordsFATE/BJ-HCC-2；RNA interference；liver cancer；metastasis

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.020

中圖分類號(hào)R735.7

通信作者#，男，1963年5月生，博士，研究員，研究方向：腫瘤免疫學(xué)，E-mail:xiaoangyang@163.com