王笑朵 韓雪松

（1 沈陽(yáng)和平永嘉口腔門診部，遼寧 沈陽(yáng)110000；2 遼寧省武警總隊(duì)醫(yī)院口腔科，遼寧 沈陽(yáng) 110034）

4-1BBL在口腔鱗癌組織中的表達(dá)及臨床意義

王笑朵1韓雪松2*

（1 沈陽(yáng)和平永嘉口腔門診部，遼寧 沈陽(yáng)110000；2 遼寧省武警總隊(duì)醫(yī)院口腔科，遼寧 沈陽(yáng) 110034）

目的 分析口腔鱗癌組織中4-1BBL（4-1BB Ligand，即4-1BB配體）的表達(dá)水平以及臨床意義。方法 應(yīng)用PCR、FQ-PCR（實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)）以及免疫組化法檢測(cè)我院口腔腫瘤科獲取的63份口腔鱗癌組織標(biāo)本和35份癌旁正?？谇唤M織中4-1BBL的表達(dá)水平，對(duì)比不同組織中4-1BBL表達(dá)的差異，分析4-1BBL表達(dá)的臨床意義。結(jié)果 口腔鱗癌組織中4-1BBL mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著高于正常組織，不同分化程度的鱗癌組織4-1BBL表達(dá)程度具有顯著差異，高分化癌組織中4-1BBL表達(dá)水平最高，低分化組織中4-1BBL表達(dá)最少，P＜0.05，差異具有顯著性。結(jié)論 口腔鱗癌組織中4-1BBL表達(dá)水平顯著升高，且4-1BBL表達(dá)與癌組織分化程度具有密切關(guān)聯(lián)，分化程度越高，4-1BBL表達(dá)量越高。

口腔鱗癌；4-1BBL；臨床意義

口腔鱗癌作為口腔癌常見(jiàn)類型，不僅能夠破壞顏面美觀性，而且能夠造成嚴(yán)重功能障礙，具有較高的病死率。隨著基因組學(xué)的發(fā)展，基因?qū)τ谀[瘤的影響受到了廣泛關(guān)注，目前相關(guān)研究[1-2]證實(shí)共刺激分子4-1BBL具有抗腫瘤活性，對(duì)于癌癥的免疫治療效果、預(yù)后情況能夠產(chǎn)生重要影響。本文通過(guò)分析比較不同組織組織中4-1BBL表達(dá)的差異性，旨在分析4-1BBL對(duì)于口腔鱗癌診治的臨床價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象：選取遼寧省武警總隊(duì)醫(yī)院2010年4月至2015年6月在手術(shù)治療中留取的21份口腔鱗癌組織和19份癌旁正常組織作為實(shí)驗(yàn)檢測(cè)標(biāo)本，口腔鱗癌中女性患者11例，男性患者10例，年齡29～71歲，平均年齡（53.46±4.19）歲，其中高分化者8例，中分化者7例，低分化6例，所有患者在手術(shù)治療切取癌組織的同時(shí)留取癌旁正常組織，所有患者均在知情同意的基礎(chǔ)上接受治療和參與實(shí)驗(yàn)。病理選擇標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查證實(shí)為口腔鱗癌；②年齡＞18歲；③排除合并其他口腔疾病者；④排除轉(zhuǎn)移癌、合并全身嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病者；⑤能夠耐受手術(shù)治療，相關(guān)標(biāo)本留存完好。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料：口腔鱗癌組織、癌旁正常組織（我院病理科提供）；PCR和FQ-PCR試劑盒、Revert Aid TM First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及人4-1BB/4-1BBL（Invitrogen公司）；CPR 4-1BB引物（上海生工生物公司）；熒光定量分析儀（美國(guó)R＆D公司）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本保存：將所留標(biāo)本分為2份，其中一份用于RNA提取，保存在液氮之中，另一份用于免疫組化檢測(cè)，用多聚甲醛固定、石蠟包埋后在4 ℃下保存。

1.3.2 檢測(cè)方法：通過(guò)Trizol對(duì)口腔鱗癌組織和正常組織進(jìn)行總RNA提取之后，添加Revert Aid TM First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得總DNA，采取PCR、FQ-PCR電泳檢測(cè)4-1BBL的表達(dá)水平，F(xiàn)Q-PCR反應(yīng)體系為10 μL，在添加體系中加cDNA（1 μL）之后，參照試劑盒說(shuō)明書所列步驟進(jìn)行檢測(cè)，其反應(yīng)條件為：95 ℃下進(jìn)行5 min→94 ℃下進(jìn)行30 s→58 ℃下進(jìn)行30 s→72 ℃下進(jìn)行30 s，共完成40個(gè)循環(huán)。在本實(shí)驗(yàn)中所涉及的4-1BBL和β-actin內(nèi)參照均采取FQPCR擴(kuò)增處理，組間表達(dá)差異的計(jì)算公式為：2－△Ct（△Ct）=Ct4-1BBLCtβ-actin），得到2－△Ct（△Ct）統(tǒng)一進(jìn)行分析。免疫組化結(jié)果根據(jù)陽(yáng)性百分?jǐn)?shù)（0～4分，分?jǐn)?shù)越高，陽(yáng)性細(xì)胞越多）和染色強(qiáng)度（0～3分，分?jǐn)?shù)越高，染色強(qiáng)度越高）進(jìn)行計(jì)分，總分為0～1者為陰性，2～3為弱陽(yáng)性，4～5為陽(yáng)性，6～7為強(qiáng)陽(yáng)性，其中不低于3分者均歸于4-1BBL表達(dá)陽(yáng)性范圍。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)分析用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)分析，計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)分析，P＜0.05，差異具有顯著性。

2 結(jié) 果

經(jīng)過(guò)檢測(cè)分析后，4-1BBL在正常組織和鱗癌組織中均可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，但是其在鱗癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織，利用FQPCR進(jìn)行定量分析，將正常組織中4-1BBL的表達(dá)量作為標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)鱗癌組織中表達(dá)量約為其的2.20倍，進(jìn)一步對(duì)不同分化程度的鱗癌細(xì)胞進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低分化者的4-1BBL表達(dá)量最低，將其作為標(biāo)準(zhǔn)，中分化者約為低分化的1.52倍，高分化者約為低分化者的2.33倍，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05，差異具有顯著性。免疫組化結(jié)果顯示，正常組織中共有染色結(jié)果11例為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為31.42%，鱗癌組織共有48例為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為76.19%，其中36例高分化者有29例為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為80.56%，16例中分化者有9例為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為56.25%，13例低分化者有3例為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為23.08%，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05，差異具有顯著性。

3 討 論

4-1BBL作為腫瘤壞死因子超家族的一員[3]，能夠通過(guò)配體-受體的方式進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，其能夠維持T細(xì)胞活性，目前相關(guān)研究證實(shí)具有延長(zhǎng)免疫應(yīng)答、增強(qiáng)抗腫瘤效果的作用[4-6]。4-1BBL能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞毒性T細(xì)胞增殖參與腫瘤，目前相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)4-1BBL在多種腫瘤中均有所表達(dá)，并且其能夠通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞等細(xì)胞免疫因子活性而參與抗腫瘤效應(yīng)發(fā)生過(guò)程。目前有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織中4-1BBL表達(dá)水平顯著升高，其能夠增加細(xì)胞毒性，產(chǎn)生抗腫瘤治療的作用，而在在人口腔鱗癌組織中，4-1BBL表達(dá)水平顯著升高，其能夠提高宿主抑制腫瘤進(jìn)一步增殖，因此，對(duì)4-1BBL腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。隨著基因組學(xué)的發(fā)展，4-1BBL在腫瘤診治中意義的研究也越來(lái)越多[7]，但是針對(duì)口腔鱗癌與4-1BBL相關(guān)性的研究則是鳳毛麟角。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示4-1BBL在正常組織和口腔鱗癌組織中均可表達(dá)，其中鱗癌組織的表達(dá)水平顯著高于正常組織，而對(duì)于不同分化程度的鱗癌組織進(jìn)行分析顯示，分化程度越高，4-1BBL的表達(dá)水平越高，表明4-1BBL表達(dá)量與癌組織分化程度具有顯著相關(guān)性。綜上所述，4-1BBL在口腔鱗癌組呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與分化程度顯著相關(guān)，有望成為判斷口腔鱗癌分化程度的參考指標(biāo)。

[1] 姜文國(guó),張樹(shù)平,董秀紅,等.4-1 BBL在淋巴瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].實(shí)用癌癥雜志,2014,29(3):249-251.

[2] Kuang Y,Zhang L,Weng X,et al.Combination Immunotherapy with 4-1BBL and CTLA-4 Blockade for the Treatment of Prostate Cancer [J].Clin Develop Immunol,2012,2012,27(2):158-163.

[3] Jianhui M,Bo-Ram B,Jiawei L,et al.The TNF family member 4-1BBL sustains inflammation by interacting with TLR signaling components during late-phase activation[J].Sci Signaling,2013,6 (295):1749.

[4] 孫順濤,楊宏宇,羅娟,等.4-1BBL在人口腔鱗癌PBL-SCID鼠嵌合模型腫瘤免疫中的作用[J].中國(guó)口腔頜面外科雜志,2012,10 (5):354-358.

[5] 黃敬東,孟玉生,林玉婷,等.4-1BBL在口腔鱗癌中的表達(dá)及臨床意義[J].口腔醫(yī)學(xué)研究,2015,31(6):609-612.

[6] Bo Ram Bang ?,Sang Jick Kim ?,Yagita H,et al.Inhibition of 4-1BBL-regulated TLR response in macrophages ameliorates endotoxin-induced sepsis in mice.[J].Eur J Immunol,2015,45(3): 886-892.

[7] 匡幼林,翁小東,劉修恒,等.重組腺病毒介導(dǎo)前列腺特異性膜抗原基因和4-1BBL基因修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗體外誘導(dǎo)抗腫瘤免疫作用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2012,29(12):2376-2380.

*通訊作者：E-mail:yjckwxd@126.com