石 霖 呼延含蓉

禽流感病毒診斷技術(shù)的研究進展

石 霖 呼延含蓉

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）是一種可以引起人畜共患病的病原，由其引發(fā)的禽流感疫情不僅給養(yǎng)禽行業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，而且也給人類健康，甚至生命安全帶來了嚴(yán)重威脅。該病至今已經(jīng)給全球經(jīng)濟和公共衛(wèi)生帶來了嚴(yán)重后果。由禽流感病毒感染的家禽，其臨診癥狀及剖檢的病理變化通常會因感染禽流感病毒毒株的亞型及特點有所差異，其臨診癥狀也通常因感染家禽的種類、家禽日齡、感染情況及其他環(huán)境等不同而表現(xiàn)出不同癥狀。如高致病性禽流感（HPAI）的臨診癥狀較為明顯，其癥狀和病理變化對確診為疑似HPAI病例有一定的參考價值；然而低致病性禽流感（LPAI）感染家禽，其癥狀往往不明顯，有時臨診上難以進行確診。因此，為了有效地對禽流感病毒進行監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)流行的毒株從而控制該病毒的傳播，還需依賴于能夠準(zhǔn)確和敏感地檢測家禽病原和血清的實驗室診斷技術(shù)。近年來，國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種分子生物學(xué)及血清學(xué)檢測禽流感的試驗方法。

1 禽流感樣本的采集

對于來自活禽的樣本主要采集泄殖腔和喉氣管拭子，研究表明，泄殖腔和喉氣管拭子樣品用于檢測禽流感病毒的結(jié)果準(zhǔn)確。將棉拭子插入泄殖腔1.5～2.0cm處，旋轉(zhuǎn)后沾上糞便獲得泄殖腔拭子樣品；將棉拭子插入口腔至咽的后部直達(dá)喉氣管，輕輕擦拭并慢慢旋轉(zhuǎn)沾上氣管分泌物從而獲得喉氣管拭子樣品。將采集的棉拭子樣品置于含有抗生素的PBS離心管中，低溫保存。對于病死禽類主要采集其組織樣品，每只禽采集腸管及腸內(nèi)容物各1份，肺臟和氣管樣品各1份，肝臟、脾臟、腎臟、腦等各1份，做好標(biāo)記。在特殊條件下，也可以采集禽類的新鮮糞便。采集的病原檢測樣品應(yīng)保存于含有抗生素的PBS緩沖液中，加入抗生素的主要目的是消除任何可能干擾后續(xù)診斷的細(xì)菌。此外，從采集樣品開始，現(xiàn)場樣本應(yīng)始終嚴(yán)格保存在低溫條件下，切忌頻繁的反復(fù)凍融，因為這會導(dǎo)致病毒效價的明顯降低或者病毒分離的失敗。如果采集到的樣品不能在短期內(nèi)進行檢測，建議將所有樣品保存在-80℃冰箱內(nèi)。

2 禽流感病毒的分離培養(yǎng)

1933年，科研人員將流感病毒樣品接種到10～12胚齡SPF雞胚羊膜腔中，并首次成功分離，證實雞胚中的羊膜腔的細(xì)胞非常適合流感病毒的增殖。這種使用SPF雞胚分離禽流感病毒的方法，不僅是診斷禽流感病毒的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，而且還是可以經(jīng)過雞胚接種產(chǎn)生高效價禽流感病毒的方法。目前，除了最近發(fā)現(xiàn)的在蝙蝠上分離到的流感病毒H17N10外，幾乎所有的流感病毒均可通過該方法進行檢測。樣品接種SPF雞胚后，如果沒有血凝結(jié)，可將收集的尿囊液連續(xù)盲傳三代后重新檢測血凝結(jié)后，若仍無血凝結(jié)，則可以確定該樣品不含禽流感病毒。

然而，使用雞胚分離禽流感病毒的方法需要連續(xù)供應(yīng)現(xiàn)成的受精雞胚和培養(yǎng)雞胚的孵化器設(shè)備。為了獲得較高的病毒效價，整個病毒分離過程需要花費數(shù)天甚至數(shù)周，是耗時耗力的診斷方法，如果有疑似HPAI的樣品，則必須在生物安全三級實驗室內(nèi)進行操作。因此，雞胚病毒分離的方法并不被廣泛應(yīng)用于禽流感病毒感染的常規(guī)診斷中。但是，該方法可以提供大量的具有傳染性的活病毒，因此在研究機構(gòu)，尤其是禽流感參考實驗室可以利用這種培養(yǎng)系統(tǒng)分離培養(yǎng)高效價的病毒，進一步用于病毒的生物學(xué)特征研究、致病性研究、傳播機制研究等。

19世紀(jì)40年代有學(xué)者使用細(xì)胞進行流感病毒的分離培養(yǎng)，為在雞胚中不能很好生長的人或豬流感病毒提供了可行的分離培養(yǎng)方法。該方法可培養(yǎng)并且擴增病毒，這種方法比直接檢測更靈敏。同時，細(xì)胞培養(yǎng)還可以監(jiān)控細(xì)胞病理變化以及在加入紅細(xì)胞后的紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。目前，已經(jīng)有多種哺乳動物和禽類的細(xì)胞系被用于流感病毒的分離培養(yǎng)。最常用的細(xì)胞主要包括：初級恒河猴腎和恒河猴腎（LLCMK2）細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞、貂肺上皮細(xì)胞系（MvlLu）、水牛綠猴腎細(xì)胞、犬腎細(xì)胞（MDCK）、綠猴連續(xù)細(xì)胞系（Vero）、人類肺胚胎細(xì)胞（MRC5）、CA-CO-2細(xì)胞系、鴨胚胎細(xì)胞（CCL-141）、鵝胚腎細(xì)胞（CCL-169）、鴨胚成纖維細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞等。另外，由于病毒緩慢地從感染病毒的細(xì)胞表面釋放，可以在顯微鏡下觀察到紅細(xì)胞吸附導(dǎo)致的紅細(xì)胞直接黏附在這些感染的細(xì)胞上。除了雞胚成纖維細(xì)胞外，MDCK細(xì)胞目前也被廣泛應(yīng)用于病毒分離系統(tǒng)。然而，由于禽流感病毒依據(jù)毒株不同而有不同的宿主和體外繁殖特性，同時不是所有的宿主細(xì)胞對所有的禽流感病毒亞型具有耐受性，因此有效的病毒分離只有在細(xì)胞培養(yǎng)物對其接種的病毒敏感時才能成功。此外，該方法需要將樣品快速地運輸?shù)綄嶒炇遥驗檠舆t可能導(dǎo)致病毒失活，從而不能做到從任何感染物上分離到病毒。

另一種培養(yǎng)禽流感病毒的有效技術(shù)是快速離心培養(yǎng)技術(shù)（SVC），該技術(shù)是在一個含有蓋玻片的瓶中用單一或者混合細(xì)胞系培養(yǎng)兩種細(xì)胞的單層細(xì)胞。該方法經(jīng)過低溫離心后，可以增加病毒與細(xì)胞接觸的概率，再進行培養(yǎng)，孵育24～48h后，對細(xì)胞進行熒光抗體染色、檢測，靈敏度是傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的60%以上，該技術(shù)的優(yōu)點是通過離心的方法增強了細(xì)胞的病毒感染性，從而提高了檢測的靈敏度并縮短了檢測時間（縮短到24h），該方法的檢測靈敏度與傳統(tǒng)的試管培養(yǎng)法相當(dāng)，但是高于直接熒光抗體檢測。

3 禽流感病毒的分子生物學(xué)檢測技術(shù)

分子生物技術(shù)又稱核酸檢測技術(shù)，檢測病毒核酸，即RNA或者DNA，能夠縮短實驗室診斷禽流感病毒的周期。目前，已經(jīng)建立起多種檢測禽流感病毒核酸RNA的技術(shù)，最常用的是反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）。RTPCR將來自于雞胚、細(xì)胞培養(yǎng)液或者臨診組織樣品的病毒RNA反向轉(zhuǎn)錄cDNA，然后使用禽流感病毒特異性引物擴增該cDNA，根據(jù)分子質(zhì)量不同使用瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，再使用溴化乙啶染色分析PCR產(chǎn)物，這種方法可以用于臨診疑似樣品的實驗室診斷。其主要缺點是：操作過程中可能產(chǎn)生污染，同時需要進行凝膠電泳與凝膠成像等復(fù)雜的操作。

熒光RT-PCR是在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，該反應(yīng)體系除了加入特異性檢測引物外，還加入了熒光標(biāo)記探針，通過熒光PCR儀器實時監(jiān)測PCR產(chǎn)物的數(shù)量，該方法的主要優(yōu)點為：所需時間短，2～3h即可顯示結(jié)果，無須凝膠電泳與凝膠成像等后續(xù)操作。熒光RT-PCR檢測技術(shù)是近年來應(yīng)用較多的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，目前已經(jīng)在省級以上動物疫病診斷機構(gòu)廣泛使用，該方法靈敏、快速，可對禽流感的亞型進行區(qū)分。近年來基因芯片技術(shù)發(fā)展迅速，基因芯片技術(shù)是結(jié)合一些現(xiàn)代高新技術(shù)，把核酸信息按要求固定在某些特定載體上，從而實現(xiàn)對不同生物組的分析和檢測，具有高通量、平行性分析、微量化等特點。在禽流感病毒的檢測過程中，將反轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物固定于載體上，通過熒光標(biāo)記的核酸探針與靶分子的雜交，可以區(qū)分混合體系中的擴增產(chǎn)物，借此來區(qū)分病毒亞型。王秀榮等利用基因芯片區(qū)分禽流感病毒H5、H7、H9主要亞型，為禽流感病毒診斷的快速高通量檢測奠定扎實的技術(shù)基礎(chǔ)。2000年誕生的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)（LAMP）技術(shù)是分子檢測技術(shù)的又一突破，該方法通過兩對引物，利用BstDNA聚合酶的鏈置換活性提供反應(yīng)的動力，在恒溫條件下完成對核酸的擴增反應(yīng)。該技術(shù)于恒溫條件下幾十分鐘內(nèi)即可完成，無須昂貴的儀器設(shè)備，結(jié)果可肉眼直接觀察，具有簡便、快速、靈敏度高、特異性好等特點，非常適用于基層實驗室及大型養(yǎng)殖場的檢測。近年來，已有一些成功應(yīng)用該技術(shù)對病原體進行檢測的文獻(xiàn)報道。

禽流感病毒的分子診斷方法，尤其是熒光RT-PCR檢測方法在檢疫部門應(yīng)用較多，該方法具備簡便、快速、靈敏的優(yōu)點，但是也存在分子診斷技術(shù)共有的技術(shù)問題。其中最重要的是禽流感病毒變異頻繁，病毒的基因序列可能產(chǎn)生遺傳漂移和轉(zhuǎn)變，如果引物結(jié)合位點在內(nèi)的基因序列發(fā)生改變，則該反應(yīng)將不會擴增已改變的目標(biāo)序列，使得PCR方法的精準(zhǔn)性和特異性受到影響，因此基于核酸的分子檢測需要定期根據(jù)禽流感的流行情況和變異情況對其引物序列進行更新。除此之外，還有一些因素也可以導(dǎo)致產(chǎn)生假陰性結(jié)果，如在準(zhǔn)備樣品過程中，混在病原體內(nèi)的抑制物、病毒的效價較低、目標(biāo)RNA在擴增前出現(xiàn)了降解以及配制反應(yīng)體系時出現(xiàn)了錯誤等，其中RNA質(zhì)量問題是最重要的，使用降解的RNA或無效的PCR反應(yīng)會使結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，遵循嚴(yán)格的操作程序是非常重要的。

此外，從mRNA到cDNA的互補轉(zhuǎn)變具有高度多樣性，選擇不同的反轉(zhuǎn)錄酶會使RT-PCR結(jié)果相差很大。mRNA不是線性分子，而是通過廣泛的鏈內(nèi)堿基配對形成二級結(jié)構(gòu)，這導(dǎo)致許多由單鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)和長度可變的雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)組成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。反轉(zhuǎn)錄（Reversed Transcription，RT）步驟的效率在很大程度上依賴用于合成不針對發(fā)夾結(jié)構(gòu)的cDNA的引物，因為與核酸分子內(nèi)雜交（即mRNA與自身）動力相比核酸分子間（即引物與mRNA）雜交動力相對較弱。因此，應(yīng)選擇適合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物而不是莖狀結(jié)構(gòu)的引物。同樣重要的是，要確保在PCR引物結(jié)合位點，擴增子本身沒有二級結(jié)構(gòu)，因為在結(jié)合位點廣泛出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)會產(chǎn)生不同結(jié)果。最后，該方法檢測只能確定病原體的數(shù)量，并不能確定病原體是否具有感染能力。因此，陽性結(jié)果不一定能說明會對公共衛(wèi)生構(gòu)成了威脅，而是需要進一步的病毒分離培養(yǎng)來確定病毒的活力。

4 禽流感血清學(xué)檢測技術(shù)

在診斷禽類禽流感病毒過程中，血清學(xué)診斷方法不僅在監(jiān)測種群疫病上發(fā)揮著重要作用，同時也為禽流感病毒感染的診斷提供了一個精確的方法。血清學(xué)診斷對于家禽的LPAI病毒感染有一定的參考價值，而對在HPAI病例中禽類產(chǎn)生抗體前就已經(jīng)死亡的意義并不大。

（1）血凝和血凝抑制試驗：其原理是依據(jù)流感病毒表面的HA蛋白可與含有唾液酸的糖蛋白結(jié)合，它們之間的結(jié)合比較緊密，不經(jīng)特殊處理，難以分開，這種凝集是不可逆轉(zhuǎn)的。但該凝集可被相應(yīng)的特異性抗體所抑制，因此血凝試驗通常用來進行禽流感病毒的初步檢測，檢測時間應(yīng)控制在30min以內(nèi)，否則易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。一旦血凝試驗呈陽性結(jié)果，需要進一步考慮用特異性血清做血凝抑制試驗，與新城疫等有血凝活性的病原進行鑒別。血凝抑制試驗特異性較好，可以用來確定流感病毒的亞型。

（2）神經(jīng)氨酸酶抑制試驗：該試驗是鑒定禽流感病毒NA亞型的主要手段，其不會受到血清中非特異性因素的干擾，有較高準(zhǔn)確度，但需要注意，某些NA亞型之間可能會出現(xiàn)交叉反應(yīng)，HA的抗體也可能對NA產(chǎn)生影響。

（3）酶聯(lián)免疫吸附試驗：該方法是以抗原或抗體固相化以及酶標(biāo)記技術(shù)為基礎(chǔ)的，抗原或抗體能在固相載體表面結(jié)合且保持原有的免疫學(xué)特性，經(jīng)酶標(biāo)記后的抗原或抗體復(fù)合物既保留了免疫學(xué)特性，又具備酶的活性?？贵w結(jié)合顯色后利用酶標(biāo)儀讀取結(jié)果，進行判定。ELISA檢測方法多種多樣，常見的有間接ELISA、競爭ELISA、DOT-ELISA等，該檢測技術(shù)具有較好的敏感性和特異性，既可以檢測抗原又可以檢測抗體，是一種快速的臨床診斷方法。

（4）病毒中和試驗：該方法是較為經(jīng)典的血清學(xué)檢測手段，特異性、敏感性都比較好，同時可以測量動物體內(nèi)中和抗體含量，但由于操作較煩瑣、耗時，當(dāng)涉及具有感染性病毒時需要在生物安全級別較高的實驗室操作，這使得該方法幾乎不應(yīng)用于臨床快速診斷。

（5）瓊脂凝膠擴散試驗：根據(jù)免疫沉淀原理，抗原和抗體可以通過懸浮的間質(zhì)擴散到反應(yīng)區(qū)域，當(dāng)抗原和抗體發(fā)生反應(yīng)時，就會在瓊脂糖介質(zhì)上產(chǎn)生一條白色沉淀線。該方法操作簡便、特異性較高，但是敏感性較低，對抗原、抗體要求高，病毒必須經(jīng)過裂解，故其已經(jīng)很少使用。

（6）間接免疫熒光試驗：該方法使用標(biāo)記有熒光素的抗原或抗體進行反應(yīng)來對流感病毒進行鑒定，具有簡便易操作、敏感、費用低等特點。

摘自《黑龍江畜牧獸醫(yī)》2016（05上）