宋玲鈺，劉麗娜，徐志祥，宗愛(ài)珍，賈 敏，徐同成，劉振華，杜方嶺，韓 偉

(1山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，濟(jì)南 250100；2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271000；3山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，濟(jì)南 250100)

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多肽的降膽固醇活性研究進(jìn)展

宋玲鈺1，2，劉麗娜2，徐志祥1，宗愛(ài)珍2，賈 敏2，徐同成2，劉振華2，杜方嶺2，韓 偉3

(1山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，濟(jì)南 250100；2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271000；3山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，濟(jì)南 250100)

近年來(lái)，具有降低血液中膽固醇含量功能的多肽逐漸成為活性肽的研究熱點(diǎn)。本文論述了降膽固醇活性肽的作用機(jī)理和檢測(cè)方法，并對(duì)降膽固醇活性肽的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

降膽固醇活性肽；作用機(jī)理；檢測(cè)方法；應(yīng)用

統(tǒng)計(jì)顯示，血清總膽固醇含量增加0.6mmol/L，冠心病的風(fēng)險(xiǎn)將增加34%[1]，保持正常的膽固醇水平能大大降低患冠心病的機(jī)率。高膽固醇血癥是高血脂癥的一種，他汀類(lèi)是攻克高膽固醇血癥的理想藥物，需長(zhǎng)期服用，然而長(zhǎng)期服用他汀類(lèi)藥物不僅經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較重，而且會(huì)帶來(lái)一定的副作用，可導(dǎo)致患者血糖異常，肌無(wú)力肌痛，肝酶異常以及記憶和認(rèn)知障礙，有非常嚴(yán)重的安全隱患。研究發(fā)現(xiàn)，從食物蛋白中獲得的具有降膽固醇作用的小肽，不僅效果好，且天然無(wú)害。本文根據(jù)降膽固醇活性肽的不同作用途徑綜述了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外降膽固醇活性肽的研究進(jìn)展，旨在為降膽固醇活性肽的進(jìn)一步研究提供參考。

1 降膽固醇肽的作用機(jī)理

降膽固醇肽主要通過(guò)抑制膽固醇的吸收、合成以及降低體內(nèi)膽固醇的含量來(lái)實(shí)現(xiàn)降膽固醇的功效。

1.1 抑制膽固醇的吸收——與膽汁酸結(jié)合

膽汁酸與膽固醇的合成、分泌、吸收以及代謝等都有密切聯(lián)系：①膽汁酸通過(guò)肝腸循環(huán)參與合成膽固醇。②膽汁酸促進(jìn)膽固醇的分泌。③膽汁酸促進(jìn)腸道吸收膽固醇[2]。④膽酸汁為1/3的膽固醇提供代謝途徑。⑤被吸收的膽酸汁對(duì)其自身合成和膽固醇分解進(jìn)行負(fù)反饋。

1.2 抑制膽固醇的合成

1.2.1 抑制HMG-CoA還原酶 人體中大部分膽固醇是在肝臟中進(jìn)行生物合成的，三羥基三甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMG-CoA還原酶)是這一過(guò)程中的主要限速酶[3]，調(diào)控內(nèi)源性膽固醇的生物合成，因此抑制HMG-CoA還原酶的活性能有效抑制膽固醇的合成。

1.2.2 激活LDLR基因的表達(dá) 研究表明，肝細(xì)胞LDL受體被激活后可提高肝細(xì)胞對(duì)LDL的吸收和降解作用。來(lái)源于β-伴球蛋白的片段f127-150能激活LDL受體，且β-伴球蛋白經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后對(duì)肝細(xì)胞LDL受體的激活作用更強(qiáng)[2]。

1.3 降低體內(nèi)膽固醇的含量

1.3.1 7α-羥化酶的激活 7α-羥化酶(CYP7A1)對(duì)內(nèi)源性膽固醇的重吸收與膽汁酸的腸肝循環(huán)有十分重要的作用。膽汁酸的腸肝循環(huán)是指游離膽汁酸經(jīng)腸道吸收進(jìn)入肝臟，轉(zhuǎn)化為結(jié)合膽汁酸，并與新合成的膽汁酸一同排入腸道的過(guò)程[4]。此過(guò)程中的限速酶為CYP7A1，所以，增加CYP7AI基因的表達(dá)量，或提高CYP7A1的酶活性，都促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)化為膽酸而排出體外，從而減少膽固醇在體內(nèi)的積累[5]。

1.3.2 抑制膽固醇的酯化 膽固醇酯化是影響血液中膽固醇含量的重要要素，在這一過(guò)程中起作用的酶是卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)和?；o酶A-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)。LCAT酶可調(diào)控膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，在血漿中將游離膽固醇會(huì)轉(zhuǎn)化為膽固醇酯，從而降低膽固醇在血液中的含量，同時(shí)將膽固醇酯運(yùn)送至肝臟代謝，完成逆轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。而ACAT 酶則是通過(guò)催化易損傷細(xì)胞的游離型膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)橹舅崮懝檀减?lái)促進(jìn)膽固醇的酯化[6]，因此抑制LCAT和ACAT的活性能降低血液中膽固醇的含量。

2 降膽固醇活性的檢測(cè)方法

2.1 體外檢測(cè)

2.1.1 模擬膽汁膠束法 膽固醇能否被小腸吸收的關(guān)鍵在于其在混合膠束中的溶解度?；钚噪哪芙档湍懼械哪懝檀己?，爭(zhēng)奪膽固醇在混合膠束的空間，以干擾膽固醇的吸收。采用超聲乳化法，制備出對(duì)人體腸道環(huán)境進(jìn)行模擬的膽汁膠束溶液，篩選出對(duì)膽固醇溶出度有影響的即為降膽固醇活性肽[7]。

2.1.2 膽汁酸螯合法 膽固醇代謝產(chǎn)生膽汁酸，膽汁酸螯合劑在小腸中通過(guò)與膽汁鹽螯合形成非水溶性復(fù)合物排出體外，阻止膽汁酸被吸收并促近膽固醇轉(zhuǎn)化為膽酸，從而減少血液中的膽固醇含量，而膽汁酸常與鈉或鉀結(jié)合形成膽酸鹽。在體外，主要是根據(jù)糠醛的顏色反應(yīng)對(duì)膽酸鹽進(jìn)行檢測(cè)，并用紫外分光光度法測(cè)定目標(biāo)化合物的結(jié)合率[8]。

2.1.3 Caco-2細(xì)胞模型法 構(gòu)建Caco-2細(xì)胞模型的方法是向處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞添加含有藥物和14C同位素標(biāo)記的膽固醇膠束溶液，共同培養(yǎng)，而后裂解細(xì)胞，用定量分析法檢測(cè)細(xì)胞中膽固醇的含量，并計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與未對(duì)照組細(xì)胞中膽固醇含量的比值[9]。

2.1.4 低密度脂蛋白受體(LDLR)模型法 LDLR調(diào)節(jié)LDL代謝并維持正常的膽固醇濃度。將LDLR基因激活，可降低血液中LDL的濃度[9]。構(gòu)建LDLR報(bào)告基因模型的方法是以血清反應(yīng)元件作靶點(diǎn)，調(diào)控 LDLR基因表達(dá)，啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系。

2.1.5 脂質(zhì)代謝調(diào)控酶活性抑制法

(1)HMG-CoA還原酶活性抑制法：HMG-CoA還原酶抑制劑的檢測(cè)方法主要有分光光度法、同位素標(biāo)記、層析法和液相色譜法。最廣泛使用的是液相色譜法，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)前后NADPH濃度的變化來(lái)評(píng)價(jià)HMG-CoA還原酶抑制劑的活性[10]。體外檢測(cè)該抑制劑的活性已成為篩選降膽固醇活性物質(zhì)的重要方法。

(2)?；oA-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)活性抑制法：20世紀(jì)末學(xué)者們開(kāi)始從微生物的代謝產(chǎn)物中篩選ACAT抑制劑，使用14C標(biāo)記游離的膽固醇來(lái)測(cè)定微粒體ACAT酶的活性，從大鼠肝微粒體中獲取ACAT酶，測(cè)定酶學(xué)反應(yīng)中產(chǎn)物的活性[11]。

2.2 體內(nèi)檢測(cè)

建立大鼠模型，正常對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，高脂飲食喂養(yǎng)高脂飲食。飼養(yǎng)結(jié)束后，采集樣品，進(jìn)行體重和肝臟系數(shù)、血清學(xué)相關(guān)指標(biāo)以及肝臟和糞便中總膽固醇和總膽汁酸含量的測(cè)定。

3 降膽固醇肽研究進(jìn)展

近年來(lái)，學(xué)者們對(duì)降膽固醇活性肽的研究主要集中在植物蛋白、動(dòng)物蛋白和乳源蛋白三個(gè)方面。

3.1 植物蛋白

在植物蛋白質(zhì)中，豆類(lèi)多肽是人們研究較早也較多的一類(lèi)物質(zhì)。例如Sugano與Goto[12]證實(shí)用微生物蛋白酶酶解得到的大豆多肽，可以降低小鼠血清中膽固醇的含量，并顯著增加膽汁鹽結(jié)合類(lèi)固醇的排泄。Pak等[13]發(fā)現(xiàn)，大豆球蛋白肽—Ile-Ala-Val-Pro-Gly-Glu-Val-Ala能抑制膽固醇生物合成還原酶—HMG-CoA的活性。王玲琴等[14]利用雙酶法制備出能降低膽固醇膠束溶解度的大豆多肽。姚余祥等[15]研究得出，鷹嘴豆肽能降低在模擬膽汁膠束溶液中膽固醇的溶解度，并降低大鼠體內(nèi)的膽固醇含量。可以看出，大豆多肽具有較好的降膽固醇功效。除了大豆，谷物中的大米和小麥也能分離出具有降膽固醇功能的肽。Lin等[16]證實(shí)，大米活性肽可提高大鼠排泄物中類(lèi)固醇含量，且大米多肽的消化率與膽固醇的吸收呈正相關(guān)。張慧娟等[17]證明，含有精米、糙米及其水解物的膳食能抑制倉(cāng)鼠體重的增加和Caco-2細(xì)胞對(duì)膽固醇的吸收，降低肝臟膽固醇的含量，且在飼喂糙米蛋白水解物的倉(cāng)鼠體內(nèi)，CYP51和CYP7A1的表達(dá)是最高的。王才立等[18]利用體外模擬膽汁膠束實(shí)驗(yàn)確定小麥胚芽多肽具有降膽固醇作用。陳雪等[19]研究表明，麥胚多肽對(duì)膽固醇具有明顯的抑制作用，且分子量越低，抑制效果越顯著。

3.2 動(dòng)物蛋白

在動(dòng)物蛋白中，降膽固醇肽的研究主要集中在魚(yú)和其他水生動(dòng)物中。例如，Wergedahl[20]等研究表明，酶解大西洋鮭得到的小肽能降低大鼠肝臟的膽固醇水平，提高HDL-C含量，降低大鼠肝臟ACAT酶的活性。朱碧英等[21]證實(shí)，鰱魚(yú)多肽能使高血脂大鼠血清TC和TG值顯著降低。歐成坤等[22]研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣活性肽能降低高血脂小鼠血清中的膽固醇含量。方俊等[23]利用菌株發(fā)酵新鮮豬血獲得的豬血多肽能降低SD高血脂模型大鼠的血清TC、TG。白利鋒[24]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，扇貝邊酶解多肽能增加小鼠糞便中總膽汁酸的含量。劉麗媛等[25]證實(shí)鯽魚(yú)酶解肽對(duì)膽固醇膠束的溶解度有明顯的抑制作用。江錕等[26]以降脂藥考來(lái)烯胺為參照，得出鱸魚(yú)蛋白酶解液在有結(jié)合膽酸鹽的能力。由此可見(jiàn)動(dòng)物蛋白也有良好的降膽固醇效果。

3.3 乳源蛋白

除了植物蛋白和動(dòng)物蛋白，乳源蛋白多肽的研究也逐漸成為焦點(diǎn)。Nagaoka[27-29]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得出，乳源蛋白生物活性肽的降膽固醇活性比植物蛋白更好；乳清蛋白肽可以顯著減少乳糜微粒膽固醇的溶解度，減少外源性膽固醇的吸收，降低血液中的膽固醇含量；還通過(guò)Caco-2細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，乳源肽Ile-Ile-Ala-Glu-Lys與?；悄懰峤Y(jié)合能降低乳糜微粒膽固醇的溶解度。Gao[30]通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)證明其可以降低血液中甘油三酯水平和動(dòng)脈硬化指數(shù)，并顯著降低血液膽固醇水平。Kensei[31]研究發(fā)現(xiàn)，從β-乳球蛋白制備的多肽Lactostatin具有降膽固醇活性，能提高小鼠肝細(xì)胞中CYP7A1的水平和mRNA 表達(dá)。

4 展望

目前，降膽固醇活性肽的作用機(jī)制還不十分清楚。國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要從體外試驗(yàn)對(duì)降膽固醇肽進(jìn)行篩選，而肽在人體的消化系統(tǒng)中很容易被酶消化，這就使一些肽在體外具有很好的降膽固醇作用，在人體內(nèi)卻不能發(fā)揮相應(yīng)的效果。另外，現(xiàn)階段關(guān)于降膽固醇肽的研究大部分是圍繞食物蛋白源進(jìn)行的，而對(duì)非食物蛋白源降膽固醇肽的研究很少，且制備方法單一。所以，今后應(yīng)重點(diǎn)對(duì)天然蛋白源的降膽固醇活性肽的結(jié)構(gòu)—活性關(guān)系和制備方法進(jìn)行進(jìn)一步研究，同時(shí)可對(duì)非食源性降膽固醇肽進(jìn)行研究和開(kāi)發(fā)，實(shí)現(xiàn)降膽固醇活性肽的批量生產(chǎn)?！?/p>

[1]Long M T，Shah N P.Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of lactobacilli strains[J].J Dairy Sci，2005，88(1)：55-66.

[2]楊玉英，王偉，張玉，等.天然蛋白源降血脂活性肽的研究進(jìn)展[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，1(9)：1162.

[3]譚紹淵.抑制膽固醇合成藥物的研究進(jìn)展[J].湖南醫(yī)學(xué)，1995，6：174-175.

[4]韓正康.家畜生理學(xué)(第三版)[M].中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000.

[5]Peet D J，et al .Cholesterol and bile acid metabolism are impaired in mice lacking the nuclear oxysterol receptor LXR alpha[J].Cell，1998，93(5)：693-704.

[6]Matsuda K.ACAT inhibitors as antiatherosclerotic agents：compounds and mechanism[J].Med Res Rev，1994，14：271.

[7]Story J A，Kritchevsky D.Comparison of the binding of various bile acids and bile salts in vitro by several types of fiber[J].The Journal of Nutrition，1976，106(9)：1292-1294.

[8]李繼珩，許東，牟曉虹.利用糠醛顯色反應(yīng)測(cè)定?；切苋パ跄懰岷縖J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1992，5：23.

[9]陳繼承，盧曉鳳，何國(guó)慶.降血脂功效成分體外篩選方法研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2010，13：287-291.

[10]于剛，曹曉鋼，葉小利，等.高效液相色譜法測(cè)定 3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶 A 還原酶抑制劑的活性[J].分析化學(xué)，2009，37(1)：87-90.

[11]唐勇，楊大軍，姚天爵.微生物來(lái)源的膽固醇?；D(zhuǎn)移酶抑制劑研究[J].中國(guó)抗生素雜志，2000，3：161-163.

[12]Sugano M.，Goto S.Cholesterol-lowering activity of various undigested fractions of soybean protein in rats[J].J.Alll.NUtn.，1990，120(9)：977-985.

[13]Pak V V，Koo M，Lee N，et al.Structure—Activity Relationships of the Peptide Ile-Ala-Val-Pro and Its Derivatives Revealed Using the Semi-Empirical AM1 Method[J].Chemistry of Natural Compounds，2005，41(4)：454-460.

[14]王玲琴，王志耕，方玉明，等.雙酶法制備大豆降膽固醇活性肽的研究[J].大豆科學(xué)，2010，29(1)：109-112.

[15]姚余祥，張久亮，何慧，等.鷹嘴豆降膽固醇肽的制備及活性[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2015，30(1)：33-38.

[16]Lin Y，et al.Rice protein extracted by different methods affects cholestrol metabolism in rats due to its lower digestibility[J].Int J Mol Sci，2011，12：7594-7608.

[17]張慧娟.大米，糙米蛋白及其酶解產(chǎn)物對(duì)脂質(zhì)代謝的影響[D].江南大學(xué)，2012.

[18]王才立.復(fù)合酶法制備小麥胚芽多肽的生物活性研究[D].齊魯工業(yè)大學(xué)，2013.

[19]陳雪，等.制備麥胚降膽固醇肽的水解條件優(yōu)化[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，24(6)：46-52.

[20]Wergedahl H，Liaset B，Gudbrandsen O A，et al.Fish protein hydrolysate reduces plasma total cholesterol，increases the proportion of HDL cholesterol，and lowers acyl-CoA：cholesterol acyltransferase activity in liver of Zucker rats[J].The Journal of Nutrition，2004，134(6)：1320-1327.

[21]朱碧英，毛秀珍.鰱魚(yú)蛋白酶解肽分子組成及其降血脂作用的初步研究[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2005，27(5)：422-424.

[22]歐成坤.酶法制備牡蠣生物活性肽新工藝研究[D].江南大學(xué)，2005.

[23]方俊，等.豬血多肽的制備及其生物活性研究[C].中國(guó)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)會(huì)第三屆會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要集.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)會(huì)，2006，1.

[24]白利鋒.扇貝邊多肽抗氧化作用及降血脂作用初步研究[D].上海海洋大學(xué)，2008.

[25]劉麗媛，等.鯽魚(yú)蛋白酶解制取魚(yú)露及其降膽固醇活性研究[J].中國(guó)食品添加劑，2012(S1)：154-158.

[26]江錕.鱸魚(yú)蛋白的酶解工藝優(yōu)化及活性肽的功能特性研究[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[27]Nagaoka S，et al.Effects of whey protein and casein on the plasma and liver lipids in rats[J].Agricultural and Biological Chemistry，1991，55(3)：813-818.

[28]Nagaoka，S.，et al.Comparative studies on the serum cholesterol lowering action of whey protein and soybean protein in rats[J].Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，1992，56(9)：1484-1485.

[29]Nagaoka，S.，et al..Soy protein peptic hydrolysate with bound phospholipids decreases micellar solubility and cholesterol absorption in rats and Caco-2 cells[J].The Journal of Nutrition，1999，129(9)：1725-1730.

[30]Gao XF.Preparation and biological functions of cholesterol-lowering activity of whey protein peptides[J].Chin Dairy Ind，2005，5：41-42.

[31]Kensei M，et al.A novel regulatory pathway for cholesterol degradation via lactostatin[J].Biochem Biophysical Res Communications，2007，352(3)：697-702.

(責(zé)任編輯 李婷婷)

Research Advancement on Cholesterol-lowering Activity of Peptides

SONG Ling-yu1，2，LIU Li-na2，XU Zhi-xiang1，ZONG Ai-zhen2，JIA Min1，XU Tong-cheng2，LIU Zhen-hua2，DU Fang-ling2，HAN Wei3

(1Institute of Agro-Food Science and Technology，Shandong Academy of Agricultural Science，Jinan 250100，China；2College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Taian 271000，China；3Shandong Academy of Agricultural Science，Jinan 250100，China)

In recent years，research on the function of peptides that could decrease cholesterol content in blood has gradually become a hot research topic.The action mechanism and detection method about cholesterol-lowering-peptide was described，and the research advancement of the active peptides was reviewed.

cholesterol-lowering-peptide；action mechanism；detection method；application

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2013AA102206)；山東省引進(jìn)泰山學(xué)者海外特聘專(zhuān)家項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：魯財(cái)教[2012]45號(hào))。

宋玲鈺(1990— )，女，在讀碩士研究生，研究方向：花生多肽的分離純化及其活性。

韓偉(1978— )，男，碩士，副研究員，研究方向：糧油加工。