張傳林，胡慶紅(遵義醫(yī)學院 藥學院，貴州 遵義 563003)

基質(zhì)固相分散-共振光散射法測定蔬果中的甲基毒死蜱

張傳林，胡慶紅*
(遵義醫(yī)學院 藥學院，貴州 遵義 563003)

建立測定蔬果中甲基毒死蜱殘留量的基質(zhì)固相分散-共振光散射新方法,為蔬果中甲基毒死蜱的快速檢測提供技術支持。以曲拉通X-100為穩(wěn)定劑，甲基毒死蜱與燦爛甲酚藍在pH值為10.00的Britton-Robinson緩沖液中相互作用，使體系共振光散射強度顯著增強，并在360 nm、544 nm處出現(xiàn)特征散射峰。甲基毒死蜱質(zhì)量濃度在0.1～5.0 μg/mL與544 nm處的散射強度有良好的線性關系，其檢出限為0.029 μg/mL。各樣品經(jīng)基質(zhì)固相分散法處理后，測得甲基毒死蜱的平均回收率為91.5%～96.8%。該方法快速、靈敏，可用于蔬果中甲基毒死蜱的檢測。

共振光散射； 甲基毒死蜱； 燦爛甲酚藍； 基質(zhì)固相分散

甲基毒死蜱是一種廣譜、高效的有機磷酸酯類殺蟲劑，廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和衛(wèi)生殺蟲。但其在體內(nèi)蓄積能引起一系列的中毒反應[1]。我國在最新實施的《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中，將多種食品中甲基毒死蜱的殘留限量暫定為5 mg/kg[2]。目前，檢測樣品中甲基毒死蜱殘留的前處理方法主要為固相萃取法[3]，檢測方法主要有高效液相色譜法[4]、氣相色譜法[5]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[6-8]等。現(xiàn)代食品安全需要發(fā)展更加快速、靈敏的檢測技術?；|(zhì)固相分散法是近些年發(fā)展起來的一種新型的樣品前處理技術，其以固相萃取填料為分散劑，將樣品與適量的分散劑充分研磨，制成均相裝入小柱后選擇合適的有機溶劑洗脫，除去基質(zhì)中的雜質(zhì)，同時完成對樣品待測組分的提取和凈化[9]。共振光散射法是近些年來發(fā)展起來的一種操作簡便、分析快速、靈敏度可達納克級的光譜新技術，在蛋白質(zhì)[10]、核酸[11-12]、免疫[13]、藥物[14-16]、無機離子[17]等分析領域得到了廣泛應用。本研究利用基質(zhì)固相分散法作為樣品前處理手段，通過研究甲基毒死蜱與燦爛甲酚藍相互作用產(chǎn)生的共振光散射光譜，建立了蔬果中甲基毒死蜱殘留量的檢測方法，以期為蔬果中甲基毒死蜱的快速檢測提供技術支持，同時拓展共振光散射技術在分析領域的應用。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

蔬果樣品購于遵義市某超市；甲基毒死蜱標準品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；燦爛甲酚藍為分析純，購自湘中精細化學品廠；丙酮、二氯甲烷、無水硫酸鎂均為分析純，曲拉通X-100、弗羅里硅土為化學純，均購自國藥集團化學試劑有限公司。無水硫酸鎂、弗羅里硅土在650 ℃馬弗爐烘烤5 h，弗羅里硅土用3%的水脫活后貯存于密封干燥器中備用。用酸度計測定配制一系列不同pH值的Britton-Robinson(B-R)緩沖溶液。

儀器包括VARIAN Cary Eclipse 熒光分光光度計(美國瓦里安公司)、TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)、90Plus PALS高靈敏度Zeta電位及粒度分析儀(美國布魯克海文儀器公司)。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 精密稱取甲基毒死蜱標準品0.020 0 g，用丙酮定容于100 mL的容量瓶中，配成200 μg/mL的儲備液，4 ℃保存，臨用時用水稀釋到20 μg/mL；精密稱取燦爛甲酚藍0.010 0 g，用水定容于100 mL的容量瓶中，備用。

1.2.2 樣品處理 將樣品洗凈，取10 g放入粉碎機中，勻漿。取1.0 g于研缽中，加入2 g無水硫酸鎂充分研磨后再與3 g弗羅里硅土研磨均勻。在層析柱底部裝1片濾紙，從下至上依次填入無水硫酸鎂0.5 g、研磨均勻的混合物、無水硫酸鎂0.5 g，每種填料填入后敲實，使填料均勻緊密地分布在柱中，柱上端再加1片濾紙。用10 mL二氯甲烷分2次洗滌研缽和淋洗層析柱，收集洗脫液，40 ℃氮氣吹干，加0.1 mL丙酮。

1.2.3 測定方法 在10 mL具塞比色管中依次加入1 mL pH值為10.00的緩沖液、1 mL質(zhì)量濃度為20 μg/mL的甲基毒死蜱標準品溶液、1 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的曲拉通X-100溶液、1 mL質(zhì)量濃度為100 μg/mL的燦爛甲酚藍溶液，用水定容至刻度，搖勻、靜置5 min，在熒光分光光度計中保持狹縫為5 nm，低壓條件下，以 λex=λem同步掃描，得到共振光散射光譜。在最大散射波長544 nm處測得散射強度值為I，不加入農(nóng)藥測得值為I0，則ΔI=I-I0。配制一系列不同質(zhì)量濃度的甲基毒死蜱標準溶液，利用粒度分析儀測定并記錄體系有效粒徑值；分別測定其散射強度，并根據(jù)ΔI和質(zhì)量濃度(c)繪制標準曲線，求出回歸方程。測定樣品處理液和空白對照液在544 nm處的散射強度值，求出ΔI，代入標準曲線回歸方程，求出樣品處理液中甲基毒死蜱的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 共振光散射光譜與吸收光譜

由圖1可知，甲基毒死蜱和燦爛甲酚藍本身的散射強度較弱；而兩者在堿性條件下相互作用后，其散射強度顯著增大，并在360 nm、544 nm處出現(xiàn)特征散射峰，隨著甲基毒死蜱質(zhì)量濃度的增大體系在最大散射波長處的散射強度值也明顯增加，表明能夠利用共振光散射法對甲基毒死蜱進行定量檢測。由圖2可知，隨著甲基毒死蜱的加入，體系在550 ～750 nm出現(xiàn)減色效應，在300 ～550 nm出現(xiàn)增色效應，并在550 nm處出現(xiàn)等吸收點。對比圖1和圖2可以看出，體系的最大散射峰位于其吸收帶內(nèi)，因此能夠產(chǎn)生共振增強的散射作用，使散射增強。

1.單獨的甲基毒死蜱溶液 (2.0 μg/mL); 2～7.不同質(zhì)量濃度甲基毒死蜱(0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μg/mL)與燦爛甲酚藍、曲拉通X-100作用后的體系圖1 甲基毒死蜱-燦爛甲酚藍體系的共振光散射光譜

1.單獨的甲基毒死蜱溶液(2.0 μg/mL); 2～4.不同質(zhì)量濃度甲基毒死蜱(4.0、2.0、0 μg/mL)與燦爛甲酚藍、曲拉通X-100作用后的體系圖2 甲基毒死蜱-燦爛甲酚藍體系的的吸收光譜

2.2 動態(tài)光散射(DLS)粒度測量

1～3為不同質(zhì)量濃度甲基毒死蜱(2.0、3.0、4.0 μg/mL)與燦爛甲酚藍、曲拉通X-100作用后的體系圖3 體系DLS粒度測量多分布圖

甲基毒死蜱質(zhì)量濃度/(μg/mL)有效粒徑/nm多分散系數(shù)2．0226．490．0033．0235．820．0494．0260．310．010

2.3 試驗條件的優(yōu)化

2.3.1 緩沖液酸度的選擇 考察不同pH值的B-R緩沖液對體系散射值的影響，結(jié)果表明，pH值為10.00時，體系有較大的ΔI(圖4)，為最佳pH值。

圖4 pH值對體系散射值的影響

2.3.2 燦爛甲酚藍質(zhì)量濃度的選擇 考察燦爛甲酚藍質(zhì)量濃度對體系散射值的影響，結(jié)果表明，燦爛甲酚藍最終質(zhì)量濃度為10～18 μg/mL時，體系ΔI較大(圖5)，試驗選擇燦爛甲酚藍的質(zhì)量濃度為10 μg/mL。

圖5 燦爛甲酚藍質(zhì)量濃度對體系散射值的影響

2.3.3 反應時間的選擇 考察了反應時間對體系散射值的影響，結(jié)果表明，體系在5～40 min有較大的ΔI(圖6)。本試驗選擇室溫反應5 min。

圖6 反應時間對體系散射值的影響

2.3.4 表面活性劑的選擇 為改善體系的穩(wěn)定性，考察了吐溫-80、曲拉通X-100、聚乙二醇-6000等表面活性劑對體系的增穩(wěn)作用，結(jié)果表明，曲拉通X-100可在一定程度上增加體系的穩(wěn)定性和散射值。試驗還發(fā)現(xiàn)，曲拉通X-100最終質(zhì)量濃度為80～120 μg/mL時，體系ΔI較大(圖7)。本試驗選擇加入100 μg/mL的曲拉通X-100。

圖7 曲拉通X-100質(zhì)量濃度對體系散射值的影響

2.3.5 樣品處理方法的優(yōu)化 參照文獻[19]選擇弗羅里硅土作為固相分散劑，分散劑與樣品的質(zhì)量比為3∶1，考察其凈化效果，發(fā)現(xiàn)當分散劑與樣品直接研磨時，由于樣品中的水分較多，降低了弗羅里硅土的活性，致使洗脫液中有大量的色素；當樣品與無水硫酸鎂充分研磨后再與分散劑一起研磨，此時洗脫液較為潔凈。

2.3.6 洗脫劑及其用量的選擇 考察了乙腈、丙酮、二氯甲烷的洗脫效果，結(jié)果表明，乙腈和丙酮作為洗脫劑時洗脫液中有大量的色素，而使用極性較小的二氯甲烷作為洗脫劑時，洗脫液中色素含量較少。同時考察了二氯甲烷用量對農(nóng)藥回收率的影響，當洗脫劑用量為10 mL時，農(nóng)藥的回收率在92.7%～99.4%，增加洗脫劑用量，農(nóng)藥回收率基本不變。因此選擇10 mL二氯甲烷作為洗脫劑。

2.4 共存物質(zhì)的影響

保持10 mL比色管中甲基毒死蜱含量為20 μg，同時加入一定量的共存物質(zhì)，按照1.2.3方法測定，考察共存物質(zhì)對體系散射值的影響。當體系測定誤差小于±10%時，共存物質(zhì)的允許量(以質(zhì)量計)為：淀粉、蔗糖、葡萄糖、Na2S、KBr、NaNO3、Na3PO4、KCl、KAc的允許量均大于2 000 μg，L-丙氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、AlCl3為500 μg，L-半胱氨酸為300 μg，BaCl2、ZnSO4、CaCl2、CuSO4為200 μg，F(xiàn)eSO4、FeCl3為80 μg，乙酰甲胺磷、咪唑啉大于600 μg，乙醇、丙酮為600 mg。

2.5 標準曲線及方法靈敏度

配制一系列不同質(zhì)量濃度的甲基毒死蜱標準溶液，根據(jù)測定的ΔI和質(zhì)量濃度(c)繪制標準曲線，結(jié)果如圖8所示，其線性回歸方程為ΔI=14.881c+1.620 6，相關系數(shù)r=0.999 2，線性范圍為0.1～5.0 μg/mL，檢出限為0.029 μg/mL。

圖8 甲基毒死蜱標準曲線

2.6 樣品測定結(jié)果

取各樣品1.0 g，按照方法1.2.2和1.2.3進行處理和測定，結(jié)果見表2。4種樣品中均未檢出甲基毒死蜱殘留，平均加標回收率為91.5%～96.8%，與高效液相色譜(HPLC)法[20]對比，結(jié)果基本一致。

表2 樣品測定及回收試驗結(jié)果(n=3)

注：ND表示未檢出。

3 結(jié)論與討論

本研究建立了一種以共振光散射技術檢測樣品中甲基毒死蜱殘留量的分析方法，甲基毒死蜱質(zhì)量濃度在0.1～5.0 μg/mL與544 nm處的散射強度有良好的線性關系，檢出限為0.029 μg/mL，各樣品中甲基毒死蜱的回收率為91.5%～96.8%，能夠滿足對蔬果中甲基毒死蜱的檢測需求。與分光光度法相比，該方法具有更高的靈敏度；與色譜檢測技術相比，該方法對設備要求較低，利用普通熒光分光光度計就能完成檢測，并且分析快速，可在短時間內(nèi)完成大批量樣品的篩選，同時無須使用大量有機溶劑，節(jié)約試驗成本。

鑒于蔬果樣品的基質(zhì)較為復雜，基質(zhì)效應會干擾檢測結(jié)果，因此本研究對樣品前處理過程進行了系列優(yōu)化。以基質(zhì)固相分散法作為前處理手段，考察了各填料的研磨順序?qū)艋Ч挠绊?，同時對比了乙腈、丙酮、二氯甲烷的洗脫效果，并考察了洗脫劑的用量，最終選擇樣品與無水硫酸鎂充分研磨后再與分散劑研磨，并以10 mL二氯甲烷作為洗脫劑來提取、凈化蔬果樣品中的甲基毒死蜱，可以降低樣品基質(zhì)對試驗測定的干擾，確保試驗結(jié)果的可靠性。

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Determination of Chlorpyrifos-methyl in Vegetables and Fruit by Matrix Solid-Phase Dispersion Extraction and Resonance Light Scattering Method

ZHANG Chuanlin,HU Qinghong*
(School of Pharmacy,Zunyi Medical College,Zunyi 563003,China)

This study aimed to establish a new resonance light scattering(RLS) method for determination of chlorpyrifos-methyl in vegetables and fruit,providing technical support for rapid detection of chlorpyrifos-methyl in vegetables and fruit.In Britton-Robinson buffer (pH=10.00),with Triton X-100 as a stabilizer,the RLS intensity of chlorpyrifos-methyl greatly enhanced when brilliant cresyl blue was added.The scattering peaks were located at 360 nm and 544 nm.The RLS intensity was linear to the concentration of chlorpyrifors-methyl in the range of 0.1—5.0 μg/mL at 544 nm with a detection limit of 0.029 μg/mL.Several samples were purified by matrix solid-phase dispersion(MSPD) and then determined.The average recoveries of chlorpyrifos-methyl in these samples ranged from 91.5% to 96.8%.This method was quick and sensitive for determination of chlorpyrifos-methyl residues in vegetables and fruit.

resonance light scattering; chlorpyrifos-methyl; brilliant cresyl blue; matrix solid-phase dispersion

2015-12-30

貴州省科學技術基金項目[黔科合J字LKZ(2011)44]

張傳林(1990-)，男，江蘇鹽城人，在讀碩士研究生，研究方向：分子光譜的分析應用。 E-mail：zhangcl1215@163.com

*通訊作者：胡慶紅(1963-)，男，貴州遵義人，教授，主要從事分子光譜的分析應用研究。 E-mail:huqinghong1963@126.com

S481+.8

A

1004-3268(2016)08-0081-05