蔡樹東，吳 雙，趙維芯，成大榮，朱善元，顧玲玲(.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 5009； .江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 500; .揚(yáng)州大學(xué) 旅游與烹飪學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 5009)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的改良及其在檢測中的應(yīng)用進(jìn)展

蔡樹東1,2，吳 雙2*，趙維芯3，成大榮1，朱善元2，顧玲玲1
(1.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009； 2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300; 3.揚(yáng)州大學(xué) 旅游與烹飪學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)是一種具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡便、擴(kuò)增高效等優(yōu)點(diǎn)的等溫核酸擴(kuò)增方法。近年來，該技術(shù)在許多方面得到了進(jìn)一步的改進(jìn)和發(fā)展，主要體現(xiàn)在多重LAMP技術(shù)的實(shí)現(xiàn)以及LAMP技術(shù)與其他技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用方面。對LAMP技術(shù)在細(xì)菌檢測、病毒檢測、寄生蟲檢測、真菌和支原體檢測、動(dòng)物胚胎性別鑒定、轉(zhuǎn)基因食品檢測以及腫瘤基因檢測中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并對LAMP技術(shù)的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望，為今后LAMP技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用提供參考。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增； 應(yīng)用； 檢測

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等[1]發(fā)現(xiàn)的一種恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，省去了PCR反應(yīng)的變性、溫度循環(huán)等一系列繁瑣的過程，節(jié)省了反應(yīng)時(shí)間，而且靈敏性比常規(guī)PCR高10倍以上。LAMP技術(shù)通過2對特異性引物對目的序列的6個(gè)區(qū)域退火雜交，利用BstDNA聚合酶的催化作用，在恒溫條件下(60～65 ℃)溫育30～60 min，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)序列的批量擴(kuò)增[2-5]。其反應(yīng)結(jié)果可直接通過肉眼觀察是否有白色焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生進(jìn)行判斷，也可通過添加羥基萘酚藍(lán)(HNB)、溴化乙淀(EB)、鈣黃綠素或SYBR Green Ⅰ等熒光染料進(jìn)行顯色觀察。

常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的分子生物學(xué)檢測方法，但由于PCR方法操作繁瑣，耗時(shí)長且對儀器設(shè)備要求較高，不適合臨床快速檢測。而LAMP技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、產(chǎn)物易檢的優(yōu)點(diǎn)且不需要昂貴的儀器和檢測試劑，尤為適合基層和現(xiàn)場病原體檢測。近年來，關(guān)于LAMP技術(shù)的研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，其方法也逐步得以改進(jìn)，因此對LAMP技術(shù)方法的改進(jìn)以及臨床應(yīng)用進(jìn)行綜述，并對其發(fā)展前景進(jìn)行展望，旨在為LAMP技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用提供參考。

1 LAMP技術(shù)的改良

LAMP技術(shù)自建立以來，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌檢測、病毒檢測、轉(zhuǎn)基因檢測以及腫瘤檢測和動(dòng)物胚胎性別鑒定等方面。隨著LAMP技術(shù)的不斷改進(jìn)與發(fā)展，逐漸向多重LAMP檢測方向發(fā)展，也有研究者將LAMP技術(shù)與其他技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合，開發(fā)了多種有效的檢測方法。

1.1 多重LAMP技術(shù)

多重LAMP檢測技術(shù)能在同一反應(yīng)體系和同一反應(yīng)條件下，實(shí)現(xiàn)對多個(gè)目標(biāo)基因的快速檢測。姜侃等[6]針對沙門菌的invA基因和金黃色葡萄球菌的nuc基因設(shè)計(jì)LAMP引物，建立了食品中沙門菌和金黃色葡萄球菌多重LAMP—熔解曲線檢測方法。結(jié)果顯示，該方法不但特異性好，而且對目標(biāo)菌的檢測靈敏度高(10 fg/μL)。袁向芬等[7]建立了豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的雙重RT-LAMP檢測方法，發(fā)現(xiàn)該方法的靈敏度與熒光定量RT-PCR相當(dāng)，比常規(guī)RT-PCR高10倍。趙軍等[8]針對蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的nhe、nuc基因設(shè)計(jì)了2套LAMP引物，并建立了同時(shí)檢測2種菌的二重LAMP檢測方法，結(jié)果表明，該二重LAMP檢測方法檢測限達(dá)10 fg/μL。陳兵等[9]建立了禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)和傳染性法氏囊病毒(IBDV)3種病毒的實(shí)時(shí)熒光多重反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(multiplex real-time revese transcription-LAMP, mRT-LAMP)檢測方法，結(jié)果表明，建立的mRT-LAMP檢測方法可對AIV、NDV、IBDV同時(shí)進(jìn)行篩選檢測，靈敏度可達(dá)到10拷貝，與單重LAMP檢測的靈敏度相當(dāng)。王彩霞等[10]建立了同時(shí)檢測貝類派琴蟲和包納米蟲的雙重LAMP方法，并且采用酶切試驗(yàn)驗(yàn)證了雙重LAMP檢測方法的準(zhǔn)確性。

1.2 LAMP技術(shù)與其他技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用

國內(nèi)外學(xué)者將LAMP技術(shù)與其他技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合，并研發(fā)了多種高效的檢測方法。Marciniak等[11]將滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)與LAMP技術(shù)相結(jié)合，成功實(shí)現(xiàn)對長為31 bp短片段核酸的快速檢測。Fang等[12]在微孔道芯片的基礎(chǔ)上，應(yīng)用LAMP技術(shù)成功檢測了假性狂犬病毒。Wang等[13]在檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌時(shí)，成功將磁珠芯片與LAMP技術(shù)相結(jié)合。Seetang-Nun等[14]在檢測白斑綜合癥病毒(WSSV)時(shí)，聯(lián)合應(yīng)用了納米金顆粒標(biāo)記的DNA探針和LAMP技術(shù)，2種技術(shù)的結(jié)合使得檢測限低至200拷貝。Ravan等[15]將LAMP技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)技術(shù)結(jié)合，建立了檢測沙門菌血清組DNA的檢測方法，結(jié)果表明，其檢測限可達(dá)4 cfu/mL。翁琳等[16]將LAMP技術(shù)與基因芯片進(jìn)行結(jié)合，對肺炎衣原體進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，LAMP技術(shù)聯(lián)合基因芯片技術(shù)具有高靈敏性和高特異性，可快速準(zhǔn)確地檢測肺炎衣原體。王瑞娜等[17]將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與橫向流動(dòng)試紙條檢測技術(shù)聯(lián)合，建立了一種可用于單核細(xì)胞增生李斯特菌檢測的方法。

2 LAMP技術(shù)的應(yīng)用

LAMP技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于病原體檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測、動(dòng)物胚胎性別的鑒定及腫瘤的基因檢測等領(lǐng)域[18-23]，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

2.1 細(xì)菌檢測

Nakamura等[24]建立了百日咳博德特氏菌的LAMP檢測方法，為新生嬰兒百日咳的快速診斷提供一種有效的手段。Song等[25]建立了布魯氏菌的LAMP檢測方法，并對4種布魯氏菌和29株非布魯氏菌進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，該LAMP方法不僅特異性強(qiáng)，而且其最低檢測限低至3.81 cfu/mL。李佳桐等[26]針對沙門菌STN基因設(shè)計(jì)了LAMP引物，并建立了檢測沙門菌的LAMP檢測方法，其檢測限為10 cfu/mL，比常規(guī)PCR的靈敏度高10倍。劉哲等[27]以產(chǎn)氣莢膜梭菌的α毒素全基因序列為保守序列設(shè)計(jì)LAMP引物，建立了產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP檢測方法，通過與常規(guī)PCR法靈敏性比較發(fā)現(xiàn)，LAMP法靈敏性是PCR法的1 000倍。劉亞娟等[28]根據(jù)豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(APP)ApxIVA基因的保守序列設(shè)計(jì)引物建立了快速檢測APP的LAMP檢測方法，并用建立的LAMP方法和SN/T 1447—2011標(biāo)準(zhǔn)公布的方法對36份臨床樣品進(jìn)行檢測分析，結(jié)果表明，2種方法的符合率為100%。此外，一些研究者還應(yīng)用LAMP方法成功檢測到了炭疽芽孢桿菌、霍亂弧菌、水中軍團(tuán)菌、遲鈍愛德華菌、牙齦卟啉單胞菌、熱帶念珠菌、奔馬赭霉暗色絲孢霉等病原微生物。

2.2 病毒檢測

2.2.1 DNA病毒 張侃等[29]針對豬偽狂犬病病毒(PRV)gB基因設(shè)計(jì)引物，建立了PRV的LAMP檢測方法，并與常規(guī)PCR方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其與常規(guī)PCR方法檢出率一致，但其最低檢測限僅為10拷貝/μL，靈敏性是常規(guī)PCR方法的100倍。Yang等[30]成功建立了人乳頭瘤病毒(HPV)和人類皰疹病毒2型(HSV-2)的LAMP檢測方法，結(jié)果表明，2種方法具有相同的反應(yīng)溫度和時(shí)間，而LAMP檢測HPV靈敏度為10拷貝/μL，檢測HSV-2的靈敏度為100拷貝/μL。此外，研究者們還成功建立了HIV-1型病毒[31]、乙肝病毒[32]等DNA病毒的LAMP檢測方法。

2.2.2 RNA病毒 Hosaka等[33]應(yīng)用一步法RT-LAMP檢測方法對HIV-1的pol(integrase)基因進(jìn)行了檢測，整個(gè)反應(yīng)僅需要35 min即可完成，且靈敏度達(dá)到120拷貝/μL。Chen等[34]利用RT-LAMP法檢測了豬繁殖與呼吸綜合征病毒，發(fā)現(xiàn) RT-LAMP檢測技術(shù)較普通RT-PCR技術(shù)更快速更靈敏。鐘璟皓等[35]建立了馬爾堡病毒的LAMP可視化檢測方法，并與常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行對比，結(jié)果表明，LAMP法的靈敏度高于常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。羅思思等[36]針對H7和N9亞型AIV的HA、NA基因建立了RT-LAMP檢測方法，并進(jìn)行了特異性試驗(yàn)和靈敏性檢測，結(jié)果表明，該方法具有良好的特異性，其靈敏度為10拷貝/μL。Geng等[37]建立了人類冠狀病毒NL63的RT-LAMP檢測方法，并對該方法的特異性和敏感性進(jìn)行了評價(jià)，結(jié)果表明，該方法具有較高的特異性，其靈敏性為1 600拷貝/μL。此外，一些研究者也建立了甘蔗花葉病毒(SCMV)、高粱花葉病毒[38]等RNA病毒的RT-LAMP檢測方法。

2.3 寄生蟲檢測

LAMP技術(shù)的開發(fā)為寄生蟲病檢測提供了較為準(zhǔn)確便捷的方法。Kumagai等[39]針對28S核糖體分別設(shè)計(jì)了用于檢測日本血吸蟲的LAMP引物和常規(guī)PCR引物，并分別對感染了日本血吸蟲的釘螺進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)2種方法具有相同的靈敏度，檢測下限均為100 fg/μL。Niu等[40]和Kikuchi等[41]利用LAMP方法分別建立了大豆根結(jié)線蟲和松材線蟲的快速檢測法，大大提高了檢測效率。Adao等[42]對121名女性陰道拭子中陰道毛滴蟲進(jìn)行LAMP檢測，結(jié)果表明，利用LAMP法的檢出率為42.06%，而利用傳統(tǒng)檢測方法和常規(guī)PCR方法的檢出率分別為8.26%和7.44%，而且LAMP方法靈敏度比常規(guī)PCR高出10倍。

2.4 真菌和支原體檢測

鄧顯文等[43]建立了雞滑液支原體(MS)的LAMP可視化檢測方法，結(jié)果顯示，該方法的敏感性可達(dá)到100拷貝/μL，是常規(guī)PCR方法的10倍。Suwancharoen等[44]對收集的533份牛尿樣中鉤端螺旋體進(jìn)行LAMP檢測和常規(guī)檢測，發(fā)現(xiàn)LAMP檢測法不僅具有較強(qiáng)的特異性，而且其準(zhǔn)確性也高于常規(guī)檢測方法。因此，LAMP在真菌和支原體檢測中具有很好的應(yīng)用前景。

2.5 動(dòng)物胚胎性別鑒定

近年來，LAMP技術(shù)在動(dòng)物胚胎性別鑒定方面也得到了應(yīng)用，且準(zhǔn)確率也很高。Khamlor等[45]利用LAMP技術(shù)檢測牛胚胎性別，結(jié)果顯示，在63 ℃下反應(yīng)1 h便可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，且準(zhǔn)確性高達(dá)100%。潘宏等[46]建立了LAMP法快速鑒定水牛早期胚胎性別體系，為預(yù)知水牛性別胚胎移植奠定了基礎(chǔ)。該技術(shù)操作簡單、準(zhǔn)確率高、用時(shí)短，適合養(yǎng)殖場現(xiàn)場操作，為畜牧業(yè)發(fā)展帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益。

2.6 轉(zhuǎn)基因檢測

Chen等[47]利用LAMP方法檢測7種轉(zhuǎn)基因玉米品系，并成功用建立的方法對樣品中的轉(zhuǎn)基因玉米成分進(jìn)行了檢測。在國內(nèi)，研究者們也建立了轉(zhuǎn)基因玉米Bt176、MON89034和MON863的LAMP檢測體系[48]，并成功實(shí)現(xiàn)對樣品的檢測。Zhou等[49]建立了轉(zhuǎn)基因甘蔗中cry1Ac基因的LAMP檢測方法，結(jié)果顯示，該方法檢測甘蔗基因組DNA的最低檢測限為1.0 ng/μL。張明哲等[50]采用LAMP技術(shù)對轉(zhuǎn)基因水稻Bt63進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，LAMP技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因水稻Bt63特異性好，并且靈敏度達(dá)到0.01%。由于該技術(shù)不需要復(fù)雜儀器操作，其將會(huì)在檢驗(yàn)檢疫等一線工作中起到重要作用，成為轉(zhuǎn)基因檢測的一種有效手段。

2.7 腫瘤檢測

Livingstone等[51]采用了LAMP技術(shù)對口咽部鱗癌中人乳頭瘤病毒進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，LAMP方法的靈敏性和特異性分別達(dá)常規(guī)PCR方法的99.4%和93.2%。Hao等[52]采用RT-LAMP法檢測乳腺癌患者前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并與食品和藥物管理局批準(zhǔn)的乳腺淋巴結(jié)試驗(yàn)(BLN)以及常規(guī)病理檢查進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，該RT-LAMP方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，為臨床檢測提供了較好的方法。

3 小結(jié)與展望

LAMP是近年來新研發(fā)的一種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，雖然其原理復(fù)雜，但操作十分簡單，而且優(yōu)勢突出，該擴(kuò)增技術(shù)所需設(shè)備簡單廉價(jià)，擴(kuò)增效率極高，耗時(shí)短。此外，LAMP具有特異性強(qiáng)、靈敏度高以及產(chǎn)物檢測可視化等優(yōu)點(diǎn)。盡管LAMP技術(shù)的優(yōu)勢已被研究領(lǐng)域廣泛接受，但仍然需要對LAMP技術(shù)進(jìn)一步改進(jìn)與完善，例如，在引物的設(shè)計(jì)與篩選、產(chǎn)物的特異性檢測和分離以及反應(yīng)試劑的保存運(yùn)輸方面。通過科學(xué)技術(shù)不斷地改進(jìn)和發(fā)展，LAMP技術(shù)會(huì)在更多領(lǐng)域發(fā)揮更重要的應(yīng)用價(jià)值。

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Progress on Improvement and Development of Loop-Mediated Isothermal Amplification Method

CAI Shudong1,2,WU Shuang2*,ZHAO Weixin3,CHENG Darong1,ZHU Shanyuan2,GU Lingling1
(1.College of Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China; 2.Jiangsu Animal Husbandry and Veterinary College,Taizhou 225300,China; 3.College of Tourism and Cooking,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China)

The loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a kind of isothermal nucleic acid amplification method with high specificity,high sensitivity,fast and efficient amplification etc.Since its inception,the technology has been further improved and developed,mainly reflecting in multiplex LAMP and its combination with other technologies aspects.This paper primarily summarized its application in bacteria detection,virus detection,parasite detection,fungus and mycoplasma detection,sexing of animal embryos,genetically modified food detection and tumor gene detection in recent years,and looked into its application prospect,so as to provide reference for the development and application of LAMP technology.

loop-mediated isothermal amplification; application; detection

2015-12-12

江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院科研項(xiàng)目(NSFPT201501); 江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目-校企合作基金項(xiàng)目 (201512806029H)

蔡樹東 (1991-), 男, 甘肅武威人, 在讀碩士研究生, 研究方向：預(yù)防獸醫(yī)微生物學(xué)。 E-mail:1769507537@qq.com

*通訊作者：吳 雙 (1983-), 女, 江蘇徐州人, 副教授, 博士,主要從事動(dòng)物傳染病防控和流行病學(xué)研究。 E-mail:jswushuang@sina.cn

Q78

A

1004-3268(2016)08-0007-05