姚志蘭，鄧祖麗穎，傅宏慶,黃 平，江明香，劉永鑫，王永娟*(.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室，江蘇 泰州 00; .鄭州幼兒師范學(xué)校，河南 鄭州 0000； .湖州市安吉縣畜牧獸醫(yī)局，浙江 安吉 000；.安吉以琳生物科技有限公司，浙江 湖州 000； .阜寧縣鑫永生態(tài)飼養(yǎng)場, 江蘇 阜寧 00)

抗鵝α-干擾素單鏈抗體基因擴(kuò)增與表達(dá)

姚志蘭1，鄧祖麗穎2，傅宏慶1,黃 平3，江明香4，劉永鑫5，王永娟1*
(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室，江蘇 泰州 225300; 2.鄭州幼兒師范學(xué)校，河南 鄭州 450000； 3.湖州市安吉縣畜牧獸醫(yī)局，浙江 安吉 313000；4.安吉以琳生物科技有限公司，浙江 湖州 313000； 5.阜寧縣鑫永生態(tài)飼養(yǎng)場, 江蘇 阜寧 224400)

為制備抗鵝α-干擾素的單鏈抗體，以抗鵝α-干擾素的雜交瘤細(xì)胞株總RNA為模板，RT-PCR 法擴(kuò)增鵝α-干擾素的抗體輕、重鏈基因，再采用SOE-PCR法，以編碼柔性多肽(Gly4Ser)3為接頭，組裝出完整的鵝α-干擾素的單鏈抗體可變區(qū)片段(ScFv)基因，并將ScFv基因克隆到pGEMT-Easy載體中進(jìn)行測序分析，將測序正確的ScFv基因片段克隆入pET-30a載體中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果顯示，成功組裝了ScFv基因，其全長為726 bp，為VH- Linker-VL 結(jié)構(gòu)，其中VH 長357 bp、VL長324 bp，成功表達(dá)了ScFv蛋白，大小為 27 ku。

鵝； α-干擾素； 單鏈抗體； 測序； 表達(dá)

鵝α-干擾素屬于細(xì)胞因子家族，具有加強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷力、抑制細(xì)胞增殖、抑制病毒復(fù)制、增強(qiáng)MHC Ⅰ 類和MHC Ⅱ 類分子表達(dá)的功能[1]。定量檢測機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的干擾素，可以了解機(jī)體針對病原的免疫狀態(tài)。常用于干擾素水平檢測的方法主要有微生物法、儀器分析法和免疫分析法。免疫分析法具有操作簡便快速、成本低、靈敏度較高、分析樣本量大的優(yōu)點。目前，用于免疫檢測的抗體有單克隆抗體、多克隆抗體。隨著第三代抗體技術(shù)的誕生，單鏈抗體被逐步應(yīng)用到免疫學(xué)檢測中。單鏈抗體是由抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)通過一段連接肽(Linker)連接而成的單鏈抗體可變區(qū)片段(single-chain antibody variable fragment，ScFv)[2]，是抗原發(fā)生特異性結(jié)合的最小功能結(jié)構(gòu)單位，分子質(zhì)量為27～30 ku，其免疫特異性好，在免疫學(xué)檢測、醫(yī)學(xué)檢驗等方面已得到了廣泛應(yīng)用[3-4]。ScFv的分子質(zhì)量小，組裝和折疊的條件溫和，能適應(yīng)比其他大部分分子更廣譜的表達(dá)載體，大部分基因工程載體可被用于ScFv的表達(dá)。目前，尚未有關(guān)于鵝α-干擾素單鏈抗體的報道。為此，利用基因工程方法表達(dá)了抗鵝α-干擾素ScFv蛋白，以期為建立以鵝α-干擾素單鏈抗體技術(shù)為支撐的細(xì)胞因子快速檢測方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶、RNase抑制劑、1 kb DNA Marker、隨機(jī)引物及各種限制性內(nèi)切酶均購自Fermentas公司；pET-30a和 pGEMT-easy載體、TRIzol試劑購自美國Promega公司；DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、DNA提取試劑盒、rTaq Master Mix購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純級。

抗鵝α-干擾素的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株G1由本實驗室保存。

1.2 引物設(shè)計

[5]的方法，在柔性多肽 (Gly4Ser)3兩端分別添加重鏈和輕鏈基因序列的互補(bǔ)序列設(shè)計Linker 序列，參考文獻(xiàn)[6]設(shè)計擴(kuò)增鼠源抗體VH及VL的引物。引物序列見表1，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

表1 擴(kuò)增鼠源單鏈抗體基因的引物序列

1.3 雜交瘤細(xì)胞總RNA提取

培養(yǎng)并收集本實驗室保存的抗鵝α-干擾素的雜交瘤細(xì)胞株G1細(xì)胞，按TRIzol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。

1.4ScFv的克隆與測序

1.4.1 可變區(qū)基因擴(kuò)增 以大于1 μg的總RNA為模板，利用隨機(jī)引物參考反轉(zhuǎn)錄酶說明書反轉(zhuǎn)錄cDNA。取cDNA 5 μL，VH基因上、下游引物(VH-B、VH-F)各1 μL，按常規(guī)比例配置50 μL PCR體系，經(jīng)95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 30個循環(huán)； 72 ℃ 10 min的反應(yīng)程序后，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得VH基因。同樣以VL基因上、下游引物(VL-B和VL-F1～4)擴(kuò)增VL基因。

1.4.2 Linker-VL基因擴(kuò)增 以VL基因為模板，等摩爾的VL-F1～4的引物混合液與Linker為引物進(jìn)行Linker-VL基因的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 3 min，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得Linker-VL基因。

1.4.3ScFv全長基因擴(kuò)增 取等量VH和Linker-VL基因(各150 ng)，經(jīng)94 ℃ 2 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min擴(kuò)增得到預(yù)拼接產(chǎn)物VH-Linker-VL片段(即為全長ScFv)。以50倍稀釋的預(yù)拼接產(chǎn)物為模板，全長基因的整套引物(全-B與全-F1～4等摩爾混合)為上、下游引物進(jìn)行ScFv全長基因的拼接，反應(yīng)程序為：94 ℃ 1 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得ScFv全長基因。

參考pGEMT-easy載體說明書，連接ScFv與pGEMT-easy載體，連接產(chǎn)物按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定，獲得經(jīng)NotⅠ與SfiⅠ雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒pGEMTeasy-ScFv，送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序。

1.5 pET-ScFv的構(gòu)建與鑒定

NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pGEMTeasy-ScFv，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠分離后，切下ScFv目的條帶，純化回收后與同樣經(jīng)NdeⅠ 和XhoⅠ 雙酶切的原核表達(dá)載體pET-30a連接，常規(guī)方法獲得經(jīng)酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-ScFv。

1.6 ScFv的原核表達(dá)

將pET-ScFv轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)感受態(tài)，挑取陽性克隆分別接種含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，用1 mmol/L的IPTG在37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h后收獲細(xì)菌沉淀物并行超聲裂解，將裂解上清和沉淀分別于12% SDS-PAGE膠中分析鑒定。同時，設(shè)pET-30a空載體為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝α-干擾素可變區(qū)基因擴(kuò)增結(jié)果

提取的雜交瘤細(xì)胞總RNA質(zhì)量濃度約為1.3 μg/μL，A260/A280為2.03，質(zhì)量較高，可以用于進(jìn)一步試驗。擴(kuò)增獲得的全套VH基因經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見預(yù)期約350 bp的條帶；擴(kuò)增的全套VL基因，在約320 bp處可見清晰條帶(圖1)。

M.DNA Marker; 1.VL基因擴(kuò)增產(chǎn)物； 2.VH基因擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 鵝α-干擾素VH、VL基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2ScFv全長基因的組裝結(jié)果

將VL基因與Linker以PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增， 獲得了Linker-VL基因(中間產(chǎn)物圖略)。在PCR反應(yīng)液中完成了VH和Linker-VL的預(yù)拼接。以50倍稀釋的預(yù)拼接產(chǎn)物為模板，全長基因的整套引物為上、下游引物進(jìn)行ScFv全長基因的拼接擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約750 bp的清晰條帶，即全長ScFv(圖2)。

1.全長ScFv擴(kuò)增產(chǎn)物； M.DNA Marker圖2 鵝α-干擾素ScFv全長擴(kuò)增結(jié)果

2.3ScFv的克隆與測序結(jié)果

將ScFv全長基因克隆入pGEMT-easy載體中構(gòu)建pGEMTeasy-ScFv，重組載體經(jīng)NotⅠ和SfiⅠ雙酶切后可釋放出預(yù)期的插入片段(圖3)。隨機(jī)取2個重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，結(jié)果顯示，測定的2個質(zhì)粒序列完全一致，ScFv全長為VH- Linker-VL結(jié)構(gòu)，大小726 bp，其中VH基因357 bp，VL基因324 bp。

1.NotⅠ、SfiⅠ雙酶切pGEMTeasy-ScFv； M.DNA Marker圖3 pGEMTeasy-ScFv酶切鑒定結(jié)果

2.4 ScFv的原核表達(dá)

從圖4可以看出，將全長ScFv克隆入pET-30a中，用NdeⅠ和XhoⅠ對重組質(zhì)粒pET-ScFv進(jìn)行酶切鑒定，可見預(yù)期大小的插入片段(圖4)。重組菌pET-ScFv經(jīng)37 ℃、1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h后，超聲裂解并將上清和沉淀分別于12% SDS-PAGE膠中分析鑒定，結(jié)果顯示，在27 ku處有特異性蛋白質(zhì)表達(dá)(圖5)。

M.1kb DNA Marker; 1.Nde Ⅰ、XhoⅠ雙酶切pET-ScFv圖4 pET-ScFv酶切鑒定結(jié)果

1.pET-32a表達(dá)產(chǎn)物上清； 2.pET-32a表達(dá)產(chǎn)物沉淀； 3.pET-ScFv表達(dá)產(chǎn)物上清； 4.PET-ScFv表達(dá)產(chǎn)物沉淀； M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)圖5 ScFv重組蛋白的SDS-PAGE分析

3 討論

前人研究表明，VH-Linker-VL和VL-Linker-VH這2種特異性單鏈抗體的連接方式，前者的親和力比后者高10倍以上，而后者的表達(dá)量比前者高20倍[7-8]，考慮到所制備抗體的實際應(yīng)用需求，選取親和力比較好的VH-Linker-VL連接方式。為保證制備的ScFv能正確表達(dá)并具有生物學(xué)活性，Linker設(shè)計非常重要，要符合不干擾VH和VL的空間構(gòu)象，不引起分子動力學(xué)改變，不造成對抗原結(jié)合部位的阻礙，盡量減少蛋白酶攻擊及防止ScFv 聚集[9]。目前，重復(fù)出現(xiàn)的4個甘氨酸和1個絲氨酸(Gly4Ser)3序列是最廣泛應(yīng)用的Linker，本試驗選取了這一序列并成功表達(dá)了鵝α-干擾素的ScFv，這可以為其他單鏈抗體的設(shè)計提供參考。

良好的免疫學(xué)檢測和治療的前提是特異性好、親和力高的抗體制備。單鏈抗體結(jié)合位點單一、免疫原性低、分子質(zhì)量小且易于在基因工程載體中表達(dá)[10-12]，是近年來報道較多的一類抗體。目前，有關(guān)ScFv的應(yīng)用多集中于疾病的診斷與治療，尚未有關(guān)于細(xì)胞因子檢測的報道。本研究從抗鵝α-干擾素的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株中提取總RNA，利用基因工程方法表達(dá)了抗鵝α-干擾素ScFv，可為建立以單鏈抗體技術(shù)為支撐的細(xì)胞因子快速檢測方法奠定基礎(chǔ)。同時，重組DNA技術(shù)可以將多個單鏈抗體基因串聯(lián)表達(dá)，獲得多特異性單鏈抗體，從而克服傳統(tǒng)單克隆抗體檢測目標(biāo)單一的缺點，為多基因檢測提供可能。

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Amplification and Expression of the Single-chain Fv Gene
Specific for Goose IFN-α

YAO Zhilan1,DENGZU Liying2,FU Honqing1,HUANG Ping3,JIANG Mingxiang4,LIU Yongxin5,WANG Yongjuan1*
(1.Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College,Jiangsu Provincial Key Laboratory of Veterinary Bio-pharmaceutical High-tech Research,Taizhou 225300,China; 2.Zhengzhou Infant Normal School,Zhengzhou 450000,China; 3.Animal Husbandry and Veterinary Bureau of Anji,Anji 313000,China； 4.Anji to Lin Biological Technology Co.Ltd.,Huzhou 313000； 5.Funing County Xinyong Ecological Farms,Funing 224400,China)

In order to obtain the single chain variable fragment (ScFv) gene specific for goose IFN-α,total light and heavy domains of the immunoglobulin were amplified from the RNA isolated from anti goose IFN-α monoclonal hybridoma cells by RT-PCR method.Full length ofScFvwas assembled by overlap extension PCR with a linker containing flexible polypeptide (Gly4Ser)3.TheScFvfragment was cloned into the vector pGEMT-Easy and sequenced.And then it was cloned into pET-30a for expression.As a result,theScFvgene related to goose IFN-α,consisting of 726 bp with the structure of VH-Linker-VL was successfully amplified.The VH gene was 357 bp,while the VL gene was 324 bp.ScFv could be expressed in pET-30a(27 ku).

goose; IFN-α; single chain variable fragment; sequencing; expression

2016-02-20

江蘇省“六大人才”高峰第十二批培養(yǎng)對象支助項目(10410015002)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技支撐計劃(BE2014380)；江蘇農(nóng)牧科技學(xué)院“鳳凰人才工程”項目；江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院重點支持項目(NSFZD1405,NSFPT201510，NSFPT201512)

姚志蘭(1979-)，女，江蘇泰興人，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物傳染病防治研究。E-mail:1318575080@qq.com

*通訊作者：王永娟(1980-)，女，江蘇海門人，副教授，博士，主要從事動物傳染病防治研究。E-mail:43088591@qq.com

時間：2016-8-4 16:04:13

S852.4

A

1004-3268(2016)08-0136-04

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1092.S.20160804.1604.001.html