董 飚,秦豪榮,王 健，孫國波，紀榮超(.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 5300； .國家級水禽基因庫，江蘇 泰州 5300)

鴨A-FABP基因多態(tài)性在品種和世代間的比較分析

董 飚1，2,秦豪榮1，2,王 健1，孫國波1，2，紀榮超2
(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300； 2.國家級水禽基因庫，江蘇 泰州 225300)

為了解脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白(adipocyte fatty-acid binding protein,A-FABP)基因在不同鴨品種、世代間的突變情況，以山麻鴨、巢湖鴨、金定鴨(3個世代群體)等9個鴨品種為材料，設(shè)計2對引物，用SSCP方法檢測A-FABP基因多態(tài)性，比較不同鴨品種之間、金定鴨3個世代群體之間基因型、等位基因頻率、群體遺傳參數(shù)。結(jié)果顯示，9個鴨品種中共形成A、B、C、D 4個等位基因，對不同基因型序列進行比較發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)含子1中有6個單核苷酸突變。在9個鴨品種中，B等位基因頻率均明顯高于A、C、D。大部分鴨品種之間基因型頻率存在顯著性差異，金定鴨3個世代群體之間基因型頻率無明顯差異。所有鴨品種的群體雜合度都在0.4以上，山麻鴨、攸縣麻鴨、廣西小麻鴨、金定鴨3個世代群體均為中度多態(tài)，其他鴨品種為高度多態(tài)。除山麻鴨和臨武鴨外，其他鴨品種均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。可見，鴨不同品種中A-FABP基因具有豐富的單核苷酸多態(tài)性，采用小群保種方式，金定鴨A-FABP基因多態(tài)位點形成的基因型頻率在世代間無顯著性變化。

鴨；A-FABP基因； 單鏈構(gòu)象多態(tài)性； 單核苷酸多態(tài)性； 遺傳分析

畜禽品種資源調(diào)查報告顯示，我國目前擁有地方鴨品種資源32個[1]，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展、人們消費習(xí)慣的改變，一些特性不明顯的鴨品種飼養(yǎng)量急劇減少；同時受國外一些優(yōu)良品種的引入沖擊和雜交影響，地方鴨品種資源受到了嚴重的威脅。品種資源是育種的重要素材，保護好這些鴨品種具有重要的意義。國家和地方政府已經(jīng)探索采用基因庫、保種場和保護區(qū)的形式對鴨品種資源進行保護，且每年均投入一定量的資金。但是，鴨品種的保護工作所需投入資金一直大于產(chǎn)出，這將會對保種工作帶來巨大壓力。只有加大對鴨品種資源的開發(fā)利用，才能增強鴨產(chǎn)業(yè)的競爭力，將保護和開發(fā)兩者相結(jié)合，在開發(fā)過程中加強保護，才能使品種資源真正得到保護。我國鴨品種數(shù)量較多，這些鴨品種在體型外貌和生產(chǎn)性能方面存在明顯差異，如有些鴨品種生長速度快、產(chǎn)蛋多或脂肪沉積能力強，這些差異都是由遺傳基因控制的。

脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白(adipocyte fatty-acid binding protein,A-FABP)是脂肪酸結(jié)合蛋白中的一種，屬于細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，可以與脂肪酸結(jié)合，將脂肪酸運輸?shù)街舅嵫趸透视腿ゼ傲字暮铣晌恢?，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)脂肪合成[2]。研究報道顯示，A-FABP基因點突變可以顯著影響腹脂質(zhì)量、腹脂率、皮脂率和肌肉肌內(nèi)脂肪含量，影響肌肉的品質(zhì)[3-6]。A-FABP基因作為鴨品種資源脂肪沉積和肉品質(zhì)的影響因素之一，其序列在不同的鴨品種之間存在突變差異，這些突變形成的基因型在不同的鴨品種中所占的比例，以及在繼代繁育過程中每個品種的基因型頻率是否發(fā)生變化均不明確。鑒于此，以9個地方鴨品種為研究對象，采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism,SSCP)檢測鴨A-FABP基因多態(tài)性，統(tǒng)計基因型和等位基因頻率，分析品種之間的分布差異和群體遺傳參數(shù)，并比較金定鴨不同世代群體之間基因型、等位基因頻率和遺傳參數(shù)，以期為地方鴨品種保護和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試鴨群及基因組提取

供試鴨品種包括山麻鴨、攸縣麻鴨、巢湖鴨、靖西大麻鴨、廣西小麻鴨、金定鴨、臨武鴨、荊江麻鴨、高郵鴨品種，其中金定鴨包含3 個世代群體，分別標記為0世代、2世代、4世代。金定鴨采用4 個多父本家系等量留種，輪回交配的方法進行繼代繁育，每個家系包括公鴨10只、母鴨60 只。在10周齡時，每個鴨品種隨機挑選60 只，公母各半，每只鴨翅靜脈采血2 mL，肝素鈉抗凝，離心留取紅細胞，冷凍保存。采用常規(guī)酚/氯仿法抽提和乙醇沉淀法獲取基因組DNA，測定DNA質(zhì)量濃度后將其調(diào)整為50～100 ng/μL備用。

1.2A-FABP基因引物設(shè)計

根據(jù)A-FABP基因序列在第1、2內(nèi)含子上分別設(shè)計1對引物(表1)，用于9個供試鴨品種和金定鴨不同世代群體多態(tài)性分析，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

表1 引物基本信息

1.3A-FABP基因PCR擴增反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積為25 μL，包括10×PCR Buffer(含Mg2+) 2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、5 U/μL rTaq酶0.16 μL、50～100 ng/μL DNA模板1 μL,用雙蒸水補至25 μL。

PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。溫度降至室溫，即可從PCR儀中取出，采用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析條帶清晰，與預(yù)期片段大小一致，方可用于SSCP檢測。

1.4A-FABP基因SSCP分析及測序

5 μL PCR 產(chǎn)物和4 μL加樣緩沖液(主要成分為去離子甲酰胺)混勻，98 ℃變性10 min，然后冰水浴5 min，變性后PCR產(chǎn)物用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳過夜，電壓根據(jù)條帶位置進行調(diào)整，銀染顯色，判別基因型。

將每種純合子基因型的個體各挑選2～3個進行PCR擴增，將 PCR產(chǎn)物進行回收純化，對不同基因型進行測序，通過比對DNA序列研究不同基因型之間核苷酸變化情況。

1.5 數(shù)據(jù)處理

運用公式計算基因型頻率、等位基因頻率、純合度、雜合度和多態(tài)信息含量等遺傳參數(shù)，并卡方檢驗(χ2)各品種群體是否處于Hardy-Weinberg平衡以及基因型頻率在各品種、世代間差異程度。

2 結(jié)果與分析

2.1A-FABP基因PCR-SSCP檢測結(jié)果

通過預(yù)試驗，最終獲得了2對引物用于擴增A-FABP基因部分內(nèi)含子序列，采用SSCP方法分析了9 個地方鴨品種A-FABP基因的多態(tài)性，引物A1擴增產(chǎn)物出現(xiàn)了多態(tài)，引物A2擴增產(chǎn)物沒有出現(xiàn)多態(tài)。引物A1擴增結(jié)果顯示，不同鴨品種中有10 種基因型，4種純合型分別定義為AA、BB、CC和DD型，雜合型定義為AB、AC、AD、BC、BD和CD型(圖1)。

圖1 引物A1對不同品種鴨擴增片段的SSCP分析

2.2A-FABP基因多態(tài)性片段的克隆和測序

取AA、BB、CC和DD基因型的PCR產(chǎn)物片段進行克隆、測序。運用生物學(xué)軟件DNAMAN分析測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)4種基因型間共有6個位點發(fā)生了單核苷酸突變，其中DD型與GenBank (HQ640428.1) 中的序列一致，不同基因型之間的序列差異位點分別是內(nèi)含子1第923位點處的A→G、第943位點處的T→C、第945位點處的C→T、第952位點處的T→C、第1 000位點處的T→A和第1 037位點處的C→T突變(圖2)。

圖2 不同基因型間核苷酸序列比對

2.3A-FABP基因不同基因型(等位基因)頻率在各鴨群中的分布

由表2可知，不同鴨品種A-FABP基因多態(tài)性形成的優(yōu)勢基因型并不完全相同，在山麻鴨、攸縣麻鴨、廣西小麻鴨、高郵鴨、金定鴨3個世代群體中均以BB基因型頻率比其他基因型高，巢湖鴨以AB基因型頻率最高，靖西大麻鴨、臨武鴨以BD基因型頻率最高，荊江麻鴨以AB基因型頻率最高。9個鴨品種均以B等位基因頻率最高，超過了0.5，明顯高于A、C、D等位基因頻率。金定鴨不同基因型和等位基因頻率在世代之間發(fā)生了微小的變化，但是變化不大。

表2 不同鴨品種基因型頻率及等位基因頻率分布情況

由表3可知，山麻鴨和高郵鴨、攸縣麻鴨和荊江麻鴨、巢湖鴨和金定鴨、靖西大麻鴨和臨武鴨、廣西小麻鴨和高郵鴨之間基因型頻率存在顯著差異；靖西大麻鴨與山麻鴨、攸縣麻鴨、巢湖鴨、廣西小麻鴨、金定鴨、荊江麻鴨、高郵鴨之間基因型頻率存在極顯著差異，金定鴨與山麻鴨、臨武鴨、荊江麻鴨之間基因型頻率存在極顯著差異，臨武鴨與山麻鴨、攸縣麻鴨、巢湖鴨、廣西小麻鴨、荊江麻鴨、高郵鴨之間基因型頻率存在極顯著差異，荊江麻鴨與山麻鴨、廣西小麻鴨之間基因型頻率存在極顯著差異；其他品種兩兩之間基因型頻率無顯著性差異。由表4可知，金定鴨不同世代群體之間基因型頻率無顯著性差異。

表3 χ2檢驗不同鴨品種A-FABP基因型頻率差異

表4χ2檢驗金定鴨不同世代群體間A-FABP基因型頻率差異

群體2世代4世代0世代6．02(7)8．43(7)2世代2．16(6)

2.4 群體遺傳信息分析

從表5可以看出，山麻鴨、攸縣麻鴨、廣西小麻鴨、金定鴨3個世代群體的純合度均超過0.5；高郵鴨的純合度為0.422 9；巢湖鴨、靖西大麻鴨、臨武鴨、荊江麻鴨的純合度在0.4以下。山麻鴨、攸縣麻鴨、廣西小麻鴨、金定鴨3個世代群體的多態(tài)信息含量值介于0.25～0.50，為中度多態(tài)；其他鴨的多態(tài)信息含量值大于0.50，為高度多態(tài)。除山麻鴨和臨武鴨外，其他鴨品種均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

表5 不同鴨品種A-FABP基因多態(tài)位點遺傳參數(shù)

3 結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)，具有編碼蛋白質(zhì)的序列只占了整個基因組序列的很少部分，而絕大部分序列都在轉(zhuǎn)錄拼接過程中被切除，切除部分序列的長度與生物的復(fù)雜程度呈正比[7]。內(nèi)含子也在序列拼接過程中被切除，這是斷裂基因固有的一種轉(zhuǎn)錄模式。目前內(nèi)含子的作用尚未明確，但很多人認為其在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上對基因的表達具有調(diào)控作用，還可以降低或減緩點突變對生物體的影響，提高生物的生存能力[8]。對于內(nèi)含子的潛在作用研究尚有很多工作需要開展。本試驗根據(jù)鴨A-FABP基因序列設(shè)計了2對引物，分別位于內(nèi)含子1、2，采用SSCP方法檢測了9個地方鴨品種，其中金定鴨為小群保種方式繼代繁育的3個世代群體。發(fā)現(xiàn)了A→G、T→C、C→T、T→C、T→A和C→T 6個點突變，聚丙烯酰胺凝膠電泳中共出現(xiàn)了A、B、C、D 4種等位基因型。所有檢測品種均以B等位基因頻率最高(超過0.5)，其他3個等位基因頻率都比較低，這可能是鴨品種在進化過程中A、C、D等位基因由B等位基因突變產(chǎn)生，也可能是進化過程中B等位基因受到了自然和人為選擇而使得頻率上升。χ2檢驗分析發(fā)現(xiàn)，大部分品種之間基因型頻率差異達到了顯著性水平，這也說明了我國大部分地方鴨品種擁有獨特的A-FABP基因多態(tài)性產(chǎn)生的基因型頻率和等位基因頻率。

群體雜合度和多態(tài)信息含量用于衡量基因多態(tài)性是否豐富和群體遺傳變異程度的高低。本試驗所有鴨品種的雜合度都在0.4以上。山麻鴨、攸縣麻鴨、廣西小麻鴨、金定鴨3個世代群體的多態(tài)信息含量值在0.25～0.50，為中度多態(tài)；其他鴨品種的多態(tài)信息含量值高于0.50，為高度多態(tài)。雜合度和多態(tài)信息含量分析結(jié)果表明，供試鴨品種在A-FABP基因位點具有較高的多態(tài)信息含量，每個鴨群體內(nèi)遺傳變異大，保持了良好的遺傳信息，群體作為育種素材可用范圍較為廣泛，可供選擇利用的范圍大，尤其是基因型頻率差異不同的代表性品種更具有保種的價值。本試驗通過χ2檢驗發(fā)現(xiàn)，山麻鴨和臨武鴨偏離了Hardy-Weinberg平衡，山麻鴨可能是在保種過程群體數(shù)量較小引起了基因漂變，需要通過適當提高群體規(guī)模以產(chǎn)生較好的保種效果；臨武鴨可能是保種群體組建時間較短，由于引種的原因引起了不平衡。

目前，鴨品種資源的保護方式主要為活體保存，其他方式如DNA保存、體細胞保存都處于起始階段，其效果尚不明確。品種資源活體保護方式是采用適當?shù)娜后w規(guī)模進行繼代繁殖，通過不同的配種方法盡量縮小近交系數(shù)，其保種效果一直備受關(guān)注。目前保種效果主要是通過比較不同世代間體型外貌、生產(chǎn)性能，結(jié)合微衛(wèi)星標記技術(shù)等方法進行評估[9-10]。鑒于保種最終目的是保護好功能基因在品種間特有的基因型及其頻率，而A-FABP基因在禽類脂肪沉積和肉質(zhì)方面起著重要的作用[11-12]，本試驗以A-FABP基因內(nèi)含子中存在的多態(tài)性為基礎(chǔ)，對小群保種方式下金定鴨不同世代間的基因型頻率和群體遺傳參數(shù)進行比較，發(fā)現(xiàn)不同世代群體基因型頻率發(fā)生了微小的變化，大致保持在一定的平衡狀態(tài)，χ2檢驗不同世代間基因型頻率無顯著性差異。不同鴨品種有其相對固定的A-FABP多態(tài)性形成的基因型頻率，這些頻率決定了鴨品種脂肪沉積固有的特性，所以在品種保護工作中不僅需要從外貌和生產(chǎn)性能上保護好品種的特性，還需要從遺傳本質(zhì)上保護好品種，尤其是一些功能基因。在保種工作中可以嘗試檢測大量功能基因的突變位點，通過比較突變位點的頻率在品種世代繁育中的變化程度來衡量保種效果，其首要工作就是尋找出大量代表性功能基因的突變位點，采取有效、簡單的大規(guī)模檢測方法。

綜上，在鴨A-FABP基因內(nèi)含子1中發(fā)現(xiàn)了6個單核苷酸突變，形成了10種基因型，不同鴨品種具有豐富的多態(tài)性，大部分品種之間基因型頻率存在顯著性差異，部分達到了極顯著性差異。采用小群保種方式，金定鴨A-FABP基因多態(tài)位點形成的基因型頻率在世代間無顯著性變化，具有良好的保種效果。

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Comparative Study of Polymorphism in Breeds and Generations Based on DuckA-FABPGene

DONG Biao1,2,QIN Haorong1,2,WANG Jian1,SUN Guobo1,2,JI Rongchao2
(1.Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College，Taizhou 225300,China；2.National Gene Bank of Waterfowl Resources,Taizhou 225300,China)

The purpose was to understand the information about mutations ofA-FABPgene among different breeds and generation.Nine duck breeds(Shan Partridge duck,Chaohu duck,three generational populations of Jinding duck,and so on)were used,two pairs of primers were designed to detect polymorphism ofA-FABPgene by the technique of SSCP.The genotype frequency,allele frequency,population genetic parameter were compared among different duck breeds and three generational populations of Jinding duck.Allele A,B,C and D were found in nine duck breeds.Six mutations were found in the first intron through comparison of the sequence among different genotypes.The frequency of allele B was significantly higher than allele A,C and D among nine duck breeds.The genotype frequency was significantly different among many duck breeds,but the genotype frequency was not significantly different among Jinding duck’s three generational populations.The heterozygosity was higher than 0.4 in all duck breeds.The data ofPICindicated that Shan Partridge duck,Youxian duck,Guangxi Small Partridge duck and Jinding duck three generational populations belonged to the middle level of polymorphism,and other duck breeds belonged to the high level of polymorphism.Except for Shanma duck and Linwu duck,other duck breeds accorded with Hardy-Weinberg’s equilibrium law.Different duck breeds had affluent mononucleotide polymorphism inA-FABPgene,and the genotype frequency was significantly different in many breeds.The genotype frequency ofA-FABPgene was not significantly different in the generations of Jinding duck,which was conservancy by small population.

duck；A-FABPgene; SSCP; SNP; genetic analyses

2016-02-09

江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程項目(SXGC[2015]304)；江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新資金項目[CX(14)2072]

董 飚(1982-)，男，江蘇鹽城人，講師，碩士，主要從事水禽種質(zhì)資源保護與開發(fā)利用研究。 E-mail:dongbiao8201@126.com

S834

A

1004-3268(2016)08-0131-05