陳生雷，李鳳艷，郭華，邊少國(guó)，項(xiàng)偉，舒秀偉，苗玉和

(遼寧益康生物股份有限公司，遼寧遼陽(yáng) 111000)

一株新型鴨肝炎病毒的分離與鑒定

陳生雷，李鳳艷，郭華，邊少國(guó)，項(xiàng)偉，舒秀偉，苗玉和

(遼寧益康生物股份有限公司，遼寧遼陽(yáng) 111000)

從遼寧省某鴨場(chǎng)疑似鴨病毒性肝炎病料中分離到一株病毒，經(jīng)PCR檢測(cè)初步鑒定其為鴨肝炎病毒，命名為YK株，應(yīng)用易感鴨胚和雛鴨進(jìn)行傳代及病毒含量測(cè)定，E1～E5代鴨胚適應(yīng)毒病毒含量在106.5～106.9ELD50/0.2 mL之間，E2代鴨肝組織毒病毒含量為106.3LD50/0.1 mL。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，YK株鴨胚適應(yīng)毒E2代對(duì)7日齡雛鴨的致死率高達(dá)100%。序列測(cè)定分析表明，YK株與DHV-A的VP1基因同源性在71.4%～72.3%之間，與DHV-B的VP1基因同源性在71.9%～72.3%之間，與DHV-C的VP1基因同源性在94.3%～98.8%之間。試驗(yàn)表明，YK株與韓國(guó)新型鴨肝炎病毒在同一分支上，屬于基因C型DHV。

鴨肝炎病毒；分離；鑒定

鴨病毒性肝炎(duck viral hepatitis，DVH)是由鴨肝炎病毒(duck hepatitis virus，DHV)引起的一種傳播迅速并高度致死雛鴨的病毒性傳染病，以發(fā)病急、傳播快、病程短、死亡率高為主要特征，主要侵害4周齡以內(nèi)雛鴨，1周內(nèi)最易感，死亡率可高達(dá)90%以上[1-2]。研究表明，鴨肝炎病毒有三個(gè)血清型，即Ⅰ型(DHV-1)及其變異株(la型)、Ⅱ型(DHV-2)和Ⅲ型(DHV-3)，DHV-2和DHV-3又分別被稱為臺(tái)灣新型和韓國(guó)新型，三個(gè)血清型之間沒(méi)有交叉保護(hù)和交叉中和作用。

為了更好地研究鴨病毒性肝炎的病原，根據(jù)DHV的基因進(jìn)化規(guī)律又將其分為A、B、C型，分別對(duì)應(yīng)原有的DHV-1、臺(tái)灣新型、韓國(guó)新型[3-5]。新型的鴨肝炎病毒的出現(xiàn)給養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，戴玉婷[6]、孫林杰[7]、張雪[8]等相繼報(bào)道了與DHV-1不同的新型鴨肝炎病毒。本試驗(yàn)對(duì)遼寧省疑似鴨病毒性肝炎病鴨進(jìn)行了病原分離和鑒定，以期為鴨病毒性肝炎的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 DHV-1型病毒SDE株及其陽(yáng)性血清，由遼寧益康生物股份有限公司提供；疑似DHV病料來(lái)自遼寧省一鴨場(chǎng)的發(fā)病鴨。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 易感鴨胚及健康易感雛鴨，由遼寧益康生物股份有限公司提供，使用前檢測(cè)抗體為陰性。

1.3 試劑 核酸提取試劑盒和RT-PCR一步法試劑盒，購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司。

1.4 病毒鑒定與增殖

1.4.1 RT-PCR初步鑒定 根據(jù)GenBank中已公布的新型鴨肝炎病毒全基因序列，設(shè)計(jì)引物，上游引物：5’-AGCACGAGAGACCCTTACG-3’，下游引物：5’-CCCACAGGCTCTCACTAAAG-3’，由寶生物工程(大連)有限公司合成。將采集的病料處理后，應(yīng)用上述特異性引物按程序進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為770 bp。

1.4.2 在鴨胚上增殖 將無(wú)菌采集的病鴨肝臟在滅菌的研磨器內(nèi)充分研磨，用滅菌生理鹽水制成l︰5乳劑，3000 r/min 離心30 min，取上清液，加青、鏈霉素，使終濃度為2000 IU/mL，4 ℃過(guò)夜。取11日齡易感鴨胚20枚，分為2組，第1組為試驗(yàn)組，經(jīng)尿囊腔途徑接種病料，0.2 mL/胚；第2組為對(duì)照組，經(jīng)尿囊腔途徑接種滅菌生理鹽水，0.2 mL/胚。接種后繼續(xù)孵化，每日照蛋2次，收獲24～144 h死亡胚尿囊液，觀察胚體及內(nèi)臟病變，參照《中國(guó)獸藥典》[9]經(jīng)無(wú)菌、支原體及外源病毒檢測(cè)合格后凍干保存、備用。按此方法連續(xù)傳代。

1.4.3 在易感雛鴨上增殖 將1.4.2樣品做100倍稀釋后，經(jīng)胸部肌肉注射7日齡雛鴨，0.1 mL/只。觀察7日，無(wú)菌采集攻毒后死亡且具有典型病變的鴨肝臟，研磨后分裝，-20 ℃保存。

1.4.4 對(duì)鴨胚的半數(shù)致死量測(cè)定 取分離株鴨胚尿囊液作10倍系列稀釋，取適宜稀釋度經(jīng)尿囊腔接種11日齡易感鴨胚，每個(gè)稀釋度接種5枚，0.2 mL/枚，37 ℃孵育，觀察7日，記錄鴨胚死亡情況，按Reed-Muench 法計(jì)算鴨胚半數(shù)致死量(ELD50)[9]。

1.4.5 對(duì)易感雛鴨的半數(shù)致死量 將肝組織毒E2經(jīng)10倍系列稀釋，取適宜稀釋度經(jīng)胸部肌肉注射7日齡易感雛鴨，每個(gè)稀釋度接種6只，0.1 mL/只，觀察10日，計(jì)算雛鴨半數(shù)致死量(LD50)[9]。

1.4.6 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 取7日齡雛鴨20只，隨機(jī)分為2組，第1組將收獲的E2代鴨胚尿囊液作10倍稀釋，經(jīng)胸部肌肉接種雛鴨10只，0.2 mL/只；第2組將0.85%滅菌生理鹽水經(jīng)胸部肌肉接種雛鴨10只，0.2 mL/只，作為對(duì)照組。觀察10日，記錄發(fā)病死亡情況，死亡鴨解剖觀察病理變化。

1.4.7 特異性血清中和試驗(yàn) 采用固定病毒稀釋血清法進(jìn)行測(cè)定，將鴨胚適應(yīng)毒E2代和SDE株E2代病毒液稀釋至病毒含量為200 ELD50/0.1 mL，取適宜稀釋度SDE株陽(yáng)性血清與等量的200 ELD50病毒液混合，37 ℃中和1 h，0.2 mL/枚，同時(shí)設(shè)立血清對(duì)照和病毒對(duì)照組，5枚/組，37 ℃孵育7日，記錄各組死亡情況。1.4.8 基因序列測(cè)定與分析 將PCR產(chǎn)物送至寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將結(jié)果用DNAStar軟件進(jìn)行序列分析，參考序列見(jiàn)表1。

表1 參考序列

2 結(jié)果

2.1 分離鑒定結(jié)果 將臨床疑似鴨肝炎病例的感染動(dòng)物，采集肝組織，經(jīng)研磨處理經(jīng)RT-PCR初步鑒定為新型鴨肝炎病毒(圖1)，此病毒能在鴨胚上增殖，并能使7日齡易感雛鴨發(fā)病。

M：DL2000 Marker；1：YK株鴨胚毒；2：YK株肝組織毒；3：SDE株；4：陰性對(duì)照?qǐng)D1 RT-PCR結(jié)果

2.2 鴨胚傳代及病毒含量測(cè)定 在11日齡鴨胚上連續(xù)傳代至E5代，接種鴨胚后死亡時(shí)間主要集中在96～120 h，死亡胚皮下出血、水腫，肝臟有明顯的壞死灶或壞死點(diǎn)(圖2)，對(duì)照組鴨胚則全部存活。傳至E3代后鴨胚死亡規(guī)律，毒價(jià)穩(wěn)定，表明該分離株能很好的適應(yīng)11日齡易感鴨胚。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 鴨胚傳代死亡比例及病毒測(cè)定結(jié)果

2.3 雛鴨半數(shù)致死量測(cè)定 將YK株E2代肝組織毒應(yīng)用7日齡易感雛鴨進(jìn)行半數(shù)致死量測(cè)定，易感雛鴨于攻毒后24 h開(kāi)始死亡，死亡高峰集中在24～48 h，死亡雛鴨呈現(xiàn)典型的角弓反張狀態(tài)，剖檢肝臟有明顯的點(diǎn)狀出血。結(jié)果YK株E2代肝組織毒對(duì)雛鴨的半數(shù)致死量為106.3LD50/0.1mL。2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 第1組試驗(yàn)鴨攻毒后24 h開(kāi)始發(fā)病死亡，72 h全部死亡，死亡主要集中在攻毒后24～48 h，共死亡20只，致死率高達(dá)100%；臨床癥狀為突然發(fā)病，精神萎靡，食欲廢絕，發(fā)病片刻即倒地，先是兩腿向上作游泳樣劃動(dòng)，后頭部向后仰，呈現(xiàn)角弓反張狀。解剖死亡鴨，肝臟腫脹，呈土黃色，有明顯的出血斑點(diǎn)，其他臟器無(wú)顯著變化，剖檢結(jié)果見(jiàn)圖3。第3組對(duì)照鴨則全部健康存活。

2.5 血清中和試驗(yàn) 表3結(jié)果表明，YK株不能被Ⅰ型鴨肝炎病毒陽(yáng)性血清中和，SDE株能被Ⅰ型鴨肝炎病毒陽(yáng)性血清中和，說(shuō)明YK株和SDE株為不同血清型。

圖2 YK株接種后鴨胚及肝臟病變

圖3 攻毒后死亡雛鴨及病變肝臟

毒株鴨胚死亡比例DHV-1陽(yáng)性血清病毒對(duì)照空白對(duì)照YK株5/55/50/5DHV-1型SDE株0/55/5/

2.6 測(cè)序分析 應(yīng)用設(shè)計(jì)引物，對(duì)YK株進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增并將產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與鴨肝炎病毒VP1基因序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示，YK株與DHV-C型基因同源性為94.3%～99.0%，與臺(tái)灣新型(04G和90D)基因同源性分別為71.9%和72.3%，該分離株與DHV-C型屬于同一基因型，且與DHV-B型相鄰，但與DHV-A處于不同的分支。結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 YK株測(cè)序結(jié)果進(jìn)化分析

圖5 不同毒株基因序列比較分析

3 討論與小結(jié)

本試驗(yàn)應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)，對(duì)遼寧省某地發(fā)病鴨初步鑒定為新型鴨肝炎病毒，并使用易感鴨胚對(duì)病料進(jìn)行分離傳代培養(yǎng)，該分離株經(jīng)病毒含量測(cè)定、半數(shù)鴨胚致死量測(cè)定、本動(dòng)物回歸試驗(yàn)、血清中和試驗(yàn)鑒定為為DHV-C型鴨肝炎病毒，并命名為YK株。

目前鴨病毒性肝炎的預(yù)防與治療主要以Ⅰ型的弱毒疫苗和卵黃抗體制劑為主，但Ⅰ型和新型的鴨肝炎病毒之間不具備交叉保護(hù)。本研究中成功分離到DHV-C型鴨肝炎病毒，為進(jìn)一步研制針對(duì)DHV-C型鴨肝炎病毒的抗體制劑或疫苗奠定了基礎(chǔ)。

[1] 陸承平. 獸醫(yī)微生物學(xué)[M]. 3版. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001.

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(編輯：李文平)

Isolation and Identification of a Duck Hepatitis Virus Strain

CHEN Sheng-lei, LI Feng-yan, GUO Hua, BIAN Shao-guo,XIANG Wei, SHU Xiu-wei, MIAO Yu-he

(LiaoningYikangBiologicalCo.,Ltd,Liaoyang,Liaoning111000,China)

A virus strain was isolated from suspected duck viral disease from dead duck in liaoning Province,and identified by reverse-transcriptase polymerase chain reaction.It is a duck hepatitis virus that named YK strain.The isolates were passed from E1to E5,the titer determination in duck embryos were from 106.5to 106.9ELD50/0.2 mL; the titer determination in duckling hepatitis tissue titer was 106.3/0.1mL at E2. Animal regression experimental results showed that The YK strain in duck embryos to 7- day- old duckling mortality was 100%.Sequence comparison with DHV-A serotype showed that the identity was 71.4%～72.3%, 71.9%～72.3% with DHV-B serotype and 94.3%～98.8% with DHV-C serotype.It proves that the YK strain and new serotype strain in Korea belongs to DHV-C serotype.

duck hepatitis virus；isolation；identification

陳生雷，獸醫(yī)師，從事生物制品研究工作。E-mail: chenshenglei1028@163.com

2015-09-18

A

1002-1280 (2016) 01-0019-05

S852.65