袁野，閆恕，張丹丹，孔令聰，裴志花，劉樹明，馬紅霞,2*

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，長春 130118)

家蠅幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(Md-CBPⅠ)的表達純化及活性分析

袁野1，閆恕1，張丹丹1，孔令聰1，裴志花1，劉樹明1，馬紅霞1,2*

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，長春 130118)

為了研究家蠅幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(Md-CBPⅠ)在家蠅防御體系中的相關(guān)活性，采用PCR技術(shù)，對從雞源沙門氏菌誘導(dǎo)家蠅幼蟲構(gòu)建的抑制性消減文庫(SSH)中篩選到的家蠅幼蟲幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白Ⅰ基因(Muscadomesticachitin binding proteinⅠ,Md-CBPⅠ)進行擴增，并成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET-32a-Md-CBPⅠ，于大腸桿菌BL21(DE3)中得以高效表達，純化并獲得了Md-CBPⅠ融合蛋白。進一步對該蛋白的親和活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)Md-CBPⅠ融合蛋白對幾丁質(zhì)以及纖維素均有一定的結(jié)合作用，且其對幾丁質(zhì)的結(jié)合作用相對較好。試驗為家蠅幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白生物學(xué)活性和免疫學(xué)活性的研究奠定了基礎(chǔ)。

家蠅;幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白;克隆;原核表達

家蠅長期處于病原菌叢生的環(huán)境中，但卻不易被其所感染，根源在于其體內(nèi)所產(chǎn)生的多種抗菌物質(zhì)[1]，幾丁質(zhì)就是其產(chǎn)生的眾多抗菌物質(zhì)中的一種。在昆蟲體內(nèi)幾丁質(zhì)與幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白結(jié)合成為一種特殊的復(fù)合體:幾丁質(zhì)蛋白復(fù)合體，從而對外界損傷、攝入毒素以及病原體感染起著重要的防御作用[2-3]，該復(fù)合體也是昆蟲體壁重要的組成部分，二者的缺失將會導(dǎo)致表皮功能異常甚至喪失，并且對昆蟲的生長，體態(tài)協(xié)調(diào)，變態(tài)發(fā)育，繁殖能力有很大的影響。此外，一部分幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白還具有抗細菌、抗真菌和抗病毒活性[4]。由此可見，幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白在家蠅防御體系中起著不可或缺的作用，但該蛋白的相關(guān)活性還有待深入研究。

為此，本研究以雞源沙門氏菌誘導(dǎo)家蠅三日齡幼蟲抑制性消減文庫中篩選出來的差異基因為基礎(chǔ)，對家蠅幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白Ⅰ基因進行克隆及原核表達，并對其親和活性進行了檢測，為該蛋白的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 文庫、菌種及表達載體 雞源沙門氏菌誘導(dǎo)家蠅三日齡幼蟲SSH文庫及5'RACE-Ready cDNA由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)藥理與毒理學(xué)實驗室完成[5]，大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)以及原核表達載體pET-32a(+)由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)藥理與毒理學(xué)實驗室保存。1.1.2 主要試劑及工具酶 Ex Taq 酶，dNTP，限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ、XhoⅠ)，T4 DNA連接酶，DNA Marker(DL2000，λ-HindⅢdigest)，pMD18-T Vector，寶生物工程(大連)有限公司；異丙硫代β-D半乳糖苷(IPTG)，氨芐青霉素(AMP)，北京鼎國有限公司；DNA凝膠回收試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。1.1.3 引物合成和DNA測序 引物的合成和重組質(zhì)粒DNA測序由博仕生物工程股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1Md-CBPⅠ的篩選及全長基因的克隆 從本實驗室構(gòu)建的雞源沙門氏菌誘導(dǎo)家蠅三日齡幼蟲SSH文庫中篩選獲得家蠅差異表達序列Md-CBPⅠ，該序列與GenBank中登陸號為LOC105262293的序列相似度為98%。根據(jù)Md-CBPⅠORF序列剪掉信號肽，并用Primer5.0軟件設(shè)計全長PCR引物(表1)。

表1 Md-CBPⅠ基因的全長引物設(shè)計

以家蠅三日齡幼蟲5'-RACE-Ready cDNA為模板進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物純化后連接至pMD18-T Vector(命名為pMD18-T-Md-CBPⅠ)并轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中，隨機挑取單克隆菌落，提取質(zhì)粒并雙酶切鑒定，將陽性克隆的菌液送至博仕生物工程股份有限公司進行測序。1.2.2 生物信息學(xué)分析方法 采用ExPASy的在線軟件Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測Md-CBPⅠ編碼蛋白的理化性質(zhì)，對其序列進行分析；采用MEGA軟件進行多重序列比對分析，并使用臨位法構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹；運用EMBL工具Pfam(http://pfam.xfam.org/search/)對該基因的保守區(qū)完整性進行鑒定；根據(jù)cuticleDB 數(shù)據(jù)庫的Hidden Markov Modeling 軟件(http://bioinformatics2.biol.uoa.gr/cuticleDB/index.jsp)，預(yù)測了Md-CBPⅠ所屬的表皮蛋白家族；通過Prosite軟件(http://prosite. expasy.org/)，預(yù)測了Md-CBPⅠ基因所含有的磷酸化及糖基化等功能性位點；利用PSIPRED軟件(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)，對本基因的二級結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測并分析。

1.2.3 重組表達質(zhì)粒的表達與純化 將測序驗證后的陽性克隆子和原核表達載體pET-32a(+)經(jīng)限制內(nèi)切酶雙酶切回收后，用T4 DNA連接酶進行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中，隨機挑取單克隆菌落提取質(zhì)粒進行PCR及雙酶切鑒定，將陽性克隆菌液進行測序驗證。將測序正確的重組表達質(zhì)粒pET-32a-Md-CBPⅠ轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，挑取陽性克隆的單克隆菌落至LB(Amp)培養(yǎng)液中，1% IPTG誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)4 h時收集菌體超聲破碎，分別取上清和沉淀進行分析，處理后的產(chǎn)物經(jīng)蛋白電泳SDS-PAGE(15%)進行分析。

將以上步驟處理后的上清液加入到經(jīng)過Wash Buffer(50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，PH 8.0)平衡過后的鎳離子親和層析柱中，冰上結(jié)合2 h后收集流出液。分別用20 mL Wash Buffer平衡，200 mL Elution Buffer(10 mM-200 mM Imidazole，50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，PH 8.0)梯度洗脫，收集洗脫液。分別將20 μL流出液以及各個梯度的洗脫液處理后經(jīng)蛋白電泳SDS-PAGE(15%)進行分析。

1.2.4 pET-32a-Md-CBPⅠ融合蛋白的親和性質(zhì)分析 各取2 mL幾丁質(zhì)珠和2 mL纖維素(經(jīng)結(jié)合緩沖液處理過夜)入層析柱，將使用結(jié)合緩沖液處理后的蛋白以3倍體積加入到以上層析柱(室溫孵育3 h)并收集流出液。分別用洗滌緩沖液洗滌5次，每次孵育15 min，收集每次的流出液，最后用8 M尿素洗脫，收集洗脫液。分別將20 μL流出液以及洗脫液處理后經(jīng)蛋白電泳 SDS-PAGE(15%)進行分析[6-7]。

1.2.5 生物活性檢測 利用牛津杯法，分別檢測純化后的融合蛋白對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，沙門氏菌的生物活性。取100 μL菌液(105CFU/mL) 均勻涂布于瓊脂平板上，放入牛津杯，杯內(nèi)加入純化后的融合蛋白(4 μg/μL)，37 ℃過夜培養(yǎng)，觀察抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1Md-CBPⅠ全長基因的擴增及克隆Md-CBPⅠ經(jīng)PCR擴增后獲得348 bp大小的條帶。將純化產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，限制性內(nèi)切酶雙酶切驗證和測序驗證均為陽性，證明pMD18-T-Md-CBPⅠ構(gòu)建成功。Md-CBPⅠ全長ORF基因PCR擴增和pMD18-T-Md-CBPⅠ雙酶切鑒定(圖1)。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1：重組質(zhì)粒Md-CBPⅠ的全長PCR產(chǎn)物；2：重組質(zhì)粒pMD18-T- Md-CBPⅠ的EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切圖1 Md-CBPⅠ全長ORF基因PCR擴增和pMD18-T- Md-CBPⅠ雙酶切鑒定

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 序列分析 全長序列分析顯示該基因全長為570 bp，ORF為393 bp，剪掉信號肽后為348 bp，共編碼114個氨基酸。預(yù)測后的等電點為5.63，預(yù)測分子量約為14.1 kD。帶正電殘基(Arg+Lys)為8，帶負(fù)電殘基(Asp+Glu)為33。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為9.19，說明該蛋白很穩(wěn)定。脂肪指數(shù)為37.54，親水性系數(shù)為-2.031，說明該蛋白為親水性蛋白。

2.2.2 基因的同源性及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 系統(tǒng)進化樹分析表明Md-CBPⅠ與家蠅其它表皮蛋白和廄螫蠅表皮蛋白親緣關(guān)系較遠(圖2)。

2.2.3 編碼蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測 通過保守區(qū)鑒定后，結(jié)果顯示，Md-CBPⅠ編碼的蛋白質(zhì)在57-108位氨基酸處含有Chitin-Bind 4保守基序，該保守基序作為幾丁質(zhì)結(jié)合位點的R-R保守區(qū)域的擴展版本，為此，可以確定該家族為昆蟲表皮蛋白，屬于CPR家族(圖3)。

相關(guān)軟件預(yù)測顯示Md-CBPⅠ編碼的蛋白質(zhì)屬于表皮蛋白 RR-1亞族。該亞族存在于柔軟表皮層中，與預(yù)測中幼蟲表皮蛋白基因相符。

Prosite分析表明，該基因在102-105位氨基酸處含有磷酸化位點。可能與Md-CBPⅠ編碼的蛋白質(zhì)的功能密切相關(guān)。

圖2 Md-CBPⅠ與蠅類其它表皮蛋白的系統(tǒng)進化分析

圖3 Pfam對Md-CBPⅠ的保守區(qū)分析

2.2.4 編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)分析 β-折疊是表皮蛋白-幾丁質(zhì)相互作用所必需的基本結(jié)構(gòu)[12]，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，在幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域中β-折疊的比率高達60.7%，無α-螺旋結(jié)構(gòu)(圖4)。

圖4 Md-CBPⅠ的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3 重組表達質(zhì)粒的表達與純化 將重組表達質(zhì)粒通過PCR及限制性內(nèi)切酶雙酶切驗證，在約348 bp處有一條清晰的條帶，與目的基因大小相符(圖5)。通過測序驗證，成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET-32a-Md-CBPⅠ。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1：重組質(zhì)粒pET-32a-Md-CBPⅠ的PCR鑒定；2：pET-32a-Md-CBPⅠ雙酶切圖5 重組質(zhì)粒pET-32a-Md-CBPⅠ的PCR及雙酶切鑒定

取重組菌誘導(dǎo)前后的表達產(chǎn)物以及破碎后的上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)的重組菌約在40 kD左右出現(xiàn)表達帶，而未誘導(dǎo)菌無此條帶(圖6)，說明融合蛋白成功獲得表達；對其可溶性行進分析，結(jié)果顯示融合蛋白主要在上清中表達，屬于可溶性表達；對融合蛋白進行純化，并將純化后的蛋白經(jīng)過蛋白電泳SDS-PAGE檢測，在約40 kD大小處得到單一條帶，表明獲得較高純度的融合蛋白(圖6)。

2.4 親和性質(zhì)分析 將流出液以及洗脫液通過蛋白電泳SDS-PAGE分析后顯示，與幾丁質(zhì)和纖維素結(jié)合的蛋白大小在40 kD左右，與目的蛋白大小一致(圖7)(為保證體外親和試驗的特異性，結(jié)合緩沖液含有較高的鹽離子濃度，并通過洗滌緩沖液反復(fù)洗滌，除去非特異性結(jié)合的蛋白[11])。在上樣量保持相同的條件下，幾丁質(zhì)親和實驗中洗脫液的濃度相對較高，結(jié)果顯示，純化后的融合蛋白均可以與幾丁質(zhì)以及纖維素特異性結(jié)合，且融合蛋白對幾丁質(zhì)的結(jié)合能力要比纖維素高。

M：低分子量蛋白Marker；1：E.coli BL21/pET-32a誘導(dǎo)后；2:E.coli BL21/pET-32a-Md-CBPⅠ誘導(dǎo)后；3:E.coli BL21/pET-32a-Md-CBPⅠ誘導(dǎo)4 h后；4-5：pET-32a-Md-CBPⅠ超聲破碎后上清及沉淀；6：純化后的融合蛋白圖6 重組質(zhì)粒pET-32a-Md-CBPⅠ表達產(chǎn)物及融合蛋白純化的SDS-PAGE分析

板塊A：幾丁質(zhì); 板塊B：纖維素；M：低分子量蛋白Marker; 1.融合蛋白; 2.流出液; 3.第一次洗滌組分;4.最后一次洗滌組分; 5.洗脫液溶出的融合蛋白圖7 pET-32a-Md-CBPⅠ融合蛋白親和性質(zhì)分析結(jié)果

由于原核表達的融合蛋白結(jié)合能力較弱，所以將洗脫液的組分濃縮。泳道5為濃縮20倍后的結(jié)果。

2.5 生物活性檢測 經(jīng)檢測純化后的融合蛋白對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，沙門氏菌均無抑菌活性。

3 討論

幾丁質(zhì)是家蠅眾多抗菌物質(zhì)中的一類，家蠅體內(nèi)含有大量高純度的幾丁質(zhì)，而幼蟲表皮和蛹殼是提取幾丁質(zhì)的主要原料，其中蛆殼中的幾丁質(zhì)含量達95%以上[8-9]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者已對家蠅幾丁質(zhì)的作用有了一定的了解，但對其編碼基因以及防御、免疫等方面的研究才剛剛起步。本研究以雞源沙門氏菌誘導(dǎo)家蠅三日齡幼蟲抑制性消減文庫中篩選出來的差異基因為基礎(chǔ)，對家蠅幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白Ⅰ基因進行克隆及原核表達，并對表達產(chǎn)物進行親和性質(zhì)分析。

根據(jù)序列分析顯示，Md-CBPⅠ屬于CPR家族，該家族是因含有R&R保守區(qū)而命名的，是節(jié)肢動物中最大的表皮蛋白家族。目前，該家族中的幾種昆蟲已經(jīng)成功獲得全基因組序列，其中對果蠅、岡比亞按蚊、西方蜜蜂、家蠶、金小蜂和赤擬谷盜的表皮蛋白基因已經(jīng)進行了詳細的人工標(biāo)注[10]。

本文首次報道了含有R&R保守序列的擴展版本chitin_bind_4的家蠅幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白。通過信號肽預(yù)測軟件，發(fā)現(xiàn)Md-CBPⅠ基因含有一個包含17個氨基酸殘基的信號肽序列，其為表皮蛋白的常見特征。Md-CBPⅠ基因?qū)儆诒砥さ鞍椎腞R-2亞家族，該家族對昆蟲表皮的硬化起著關(guān)鍵的作用，且其編碼的氨基酸序列中，含有大量的組氨酸和賴氨酸，相關(guān)研究證明，這兩種氨基酸在硬化反應(yīng)中也具有一定意義[11-12]。通過對構(gòu)建的進化樹我們發(fā)現(xiàn)，Md-CBPⅠ與家蠅其它表皮蛋白和廄螫蠅表皮蛋白親緣關(guān)系較遠。但其功能是否與其他表皮蛋白有差異，還有待于進一步研究。

此外，試驗進一步對該蛋白的親和活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)其對幾丁質(zhì)以及纖維素都有一定的結(jié)合作用，顯示了該蛋白對多糖底物的結(jié)合能力。相關(guān)文獻顯示，幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白結(jié)合多糖底物的能力可能賦予了該蛋白抗菌、抗真菌以及抗病毒活性[13-14]。試驗采用的是大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，大腸桿菌的胞質(zhì)環(huán)境是高度還原的，所產(chǎn)生的蛋白并不包含穩(wěn)定的二硫鍵，而二硫鍵是幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的一個重要特征，這可能是Md-CBPⅠ融合蛋白無抑菌活性的原因。而Md-CBPⅠ是否含有抗真菌以及抗病毒活性，或在真核表達系統(tǒng)中是否含有相應(yīng)的活性還有待進一步研究。這也驗證了篩選自雞沙門氏菌誘導(dǎo)后構(gòu)建的SSH文庫中的Md-CBPⅠ基因，其在誘導(dǎo)后表達量的增加可能對家蠅對沙門氏菌的耐受起著重要的作用。

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(編輯：陳希)

Expression，Purification and Activity Analysis of Chitin Binding Protein(Md-CBPⅠ)fromMuscadomestica

YUAN Ye1,YAN Shu1,ZHANG Dan-dan1,KONG Ling-cong1, PEI Zhi-hua1,LIU Shu-ming1, MA Hong-xia1,2*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;2.AnimalProduction&ProductQualityandSecurityoftheMinistryofEducation,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

In order to research the activities ofMd-CBPⅠ in musca domestica defence system,Md-CBPⅠwas screened from suppression subtractive library(SSH) inMuscadomesticalarvae induced bySalmonellapullorumof chickens and also amplified by PCR techniques. The recombinant expression plasmid of pET-32a-Md-CBPⅠ was constructed successfully and expressed inE.ColiBL21(DE3). fusion protein was obtained by purification, further more, the preliminary study was made on the affinity of which revealed that the fusion protein has binding affinity of both chitin and cellulose, and the affinity of chitin was stronger than cellulose. This research laid a foundation for further research on biological activity and immunological activity ofMd-CBPⅠ.

Muscadomestica; chitin binding protein; clone; prokaryotic expression

國家自然科學(xué)基金資助項目(31572574，31502121)；吉林省世行貸款農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全項目(2011-Y05)

2015-11-04

A

1002-1280 (2016) 01-0008-06

S852.65