蔡文金, 包愛情, 陸春波

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州 310012)

大黃末中沒食子酸的鑒別及含量測定方法研究

蔡文金, 包愛情, 陸春波

(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，杭州 310012)

為了完善大黃末的質(zhì)量控制方法，對大黃末中沒食子酸的薄層鑒別和含量測定方法分別進(jìn)行了研究。采用薄層色譜法鑒別沒食子酸以及高效液相色譜法測定其含量。選用Agilent Eclipse XDB-C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)為色譜柱，甲醇-0.05%磷酸溶液(5∶95)為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長為271 nm。試驗結(jié)果沒食子酸在1.064～106.4 μg/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好(r= 1.0000)；平均回收率(n=6)為97.84%(RSD=0.61%)。薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離度好。本方法準(zhǔn)確靈敏，可用于大黃末中沒食子酸的質(zhì)量控制。

大黃末；沒食子酸；薄層色譜法；高效液相色譜法

大黃末收載于《中國獸藥典》二O一O年版二部，為單味大黃制成的中獸藥散劑[1]。具有健胃消食，瀉熱通腸，涼血解毒，破積行瘀功效，用于食欲不振，實(shí)熱便秘，結(jié)癥，瘡黃疔毒，目赤腫痛，燒傷燙傷，跌打損傷，還可以用于治療魚腸炎，爛鰓，腐皮[2]。大黃為常用中藥, 主要含有蒽醌類、二苯乙烯苷類、苯丁酮類, 鞣質(zhì)及相關(guān)的多酚類成分。現(xiàn)代藥理表明蒽醌類為大黃瀉下作用的主要有效成分，沒食子酸等鞣質(zhì)為大黃收斂止血作用的主要有效成分[3]。大黃末現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有蒽醌類的薄層色譜鑒別和含量測定，無鞣質(zhì)的鑒別和含量測定。查閱文獻(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)有大黃中沒食子酸薄層色譜鑒別的相關(guān)報道，本試驗參照石榴皮藥材中的沒食子酸鑒別[1]和含量測定方法[4-5]，對大黃末中沒食子酸的薄層鑒別和含量測定方法分別進(jìn)行了研究。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695 高效液相色譜儀，配Waters 2996二極管陣列檢測器，美國Waters公司；AUTOMATIC TLC SAMPLER 4全自動點(diǎn)樣儀，ADC2自動展開儀和TLC VISUALIZER 薄層色譜成像系統(tǒng)，瑞士KAMAG公司； XS-205電子天平(感量0.01 mg)，瑞士METTLER TOLEDO公司；KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑與材料 甲醇為色譜純，Merck 公司，其余試劑均為分析純；實(shí)驗用水為milli-Q 超純水。硅膠G薄層板，100 mm×200 mm，厚度0.20～0.25 mm，青島海洋化工廠生產(chǎn)。沒食子酸對照品(中國食品藥品檢定檢驗院，批號：110831-201204，含量：89.9%)。大黃末樣品(批號分別為20141101，20141102，20141103)，浙江歌德動物藥業(yè)生產(chǎn)；大黃末樣品(批號分別為20150301，20150302，20150303，20141203)，浙江東貿(mào)藥業(yè)生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 沒食子酸的薄層色譜鑒別 取供試品10 g，加無水乙醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，取濾液蒸干，加水20 mL使溶解，濾過，濾液用石油醚(60～90 ℃)提取2次，每次20 mL，棄去石油醚液，水液再用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取沒食子酸對照品10 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。照薄層色譜法，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷(用水飽和)-乙酸乙酯-甲酸(6:5:1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。斑點(diǎn)清晰，分離度好。結(jié)果見圖1。

圖1 沒食子酸薄層鑒別圖譜

2.2 沒食子酸的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.05%磷酸溶液(5∶95)；流速1.0 mL/min；采集波長200～400 nm，分辨率為1.2 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫30 ℃。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品23.68 mg，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，為對照品儲備液。精密量取上述溶液5 mL，置100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得21.29 μg/mL的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取大黃末約0.1 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加水20 mL，超聲提取30 min，靜置30 min，再加水至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 分別取對照品溶液、供試品溶液注入液相色譜儀，同時記錄光譜圖和271 nm處的色譜圖，分別見圖2、圖3。在該色譜條件下，理論板數(shù)按沒食子酸峰計為10403，沒食子酸可以得到很好的分離。

圖2 沒食子酸光譜圖

圖3 對照品溶液(A)和供試品溶液(B)色譜圖

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取對照品儲備液適量，用水稀釋成濃度約為1、2、5、10、20、50、100 μg/mL的系列溶液，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性方程為：

Y=64897X-11277(r=1.0000)。結(jié)果表明沒食子酸對照品溶液在1.064～106.4 μg/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。2.2.6 精密度試驗 精密量取濃度為53.22 μg/mL的對照品溶液20 μL注入液相色譜儀，按2.2.1色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果沒食子酸峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.4 %，表明精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液(批號20141103)，分別在樣品處理后的0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，測定峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.8%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗 取大黃末樣品(批號20141103)5份，按“2.2.3”項下的方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測定含量。結(jié)果樣品中沒食子酸含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.7%，說明方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 取“2.2.8”項下已測含量的大黃末樣品(批號20141103)0.05 g，共 6份，精密稱定，置25 mL量瓶中，分別加212.9 μg/mL沒食子酸對照品儲備液850 μL，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下條件檢測，回收率結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果

2.2.10 樣品的測定 取供試品溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算沒食子酸含量，結(jié)果見表2。

3 討論與小結(jié)

3.1 TLC鑒別中展開系統(tǒng)以及薄層板的選擇 考察了乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶1∶1∶1)、甲苯(用水飽和)-乙酸乙酯-甲酸(6∶3∶1)、石油醚(60～90℃)(用水飽和)-乙酸乙酯-甲酸(6∶5∶1)以及環(huán)己烷(用水飽和)-乙酸乙酯-甲酸(6∶5∶1)4種展開系統(tǒng)，結(jié)果表明：采用乙酸乙酯-丁

表2 大黃末中沒食子酸含量測定結(jié)果

酮-甲酸-水(10:1:1:1)色譜系統(tǒng)分離度較差；采用甲苯(用水飽和)-乙酸乙酯-甲酸(6∶3∶1)Rf值為0.16，偏小；采用石油醚(60℃～90℃)(用水飽和)-乙酸乙酯-甲酸(6∶5∶1)以及環(huán)己烷(用水飽和)-乙酸乙酯-甲酸(6∶5∶1)分離度均較好，Rf值分別為0.57和0.60，但前者的斑點(diǎn)有擴(kuò)散，綜合考慮采用環(huán)己烷(用水飽和)-乙酸乙酯-甲酸(6∶5∶1)作為展開系統(tǒng)。

對硅膠G薄層板及聚酰胺薄膜做了比較，采用5 μL點(diǎn)樣，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液以后觀察，硅膠G薄層板顯色更清晰，因此選用硅膠G薄層板。

3.2 含量測定中流動相及超聲條件的選擇 采用DAD在200 nm～400 nm進(jìn)行全波長掃描，沒食子酸對照品，在215.6 nm與271.0 nm波長處有最大吸收，215.6 nm波長太短，試劑容易產(chǎn)生干擾，故選擇271 nm波長作為檢測波長。參考文獻(xiàn)[4-6]對流動相的組成及不同比例進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)流動相中加入磷酸有助于改善峰型，減少拖尾。選擇甲醇-0.1%磷酸溶液(15∶85)、甲醇-0.05%磷酸溶液(5∶95)、乙腈-0.05%磷酸溶液(5∶95)等系統(tǒng)作為流動相，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用甲醇-0.05%磷酸溶液(5∶95)為流動相，沒食子酸與其他組分色譜峰可以得到較好的分離。

分別選擇超聲、加熱回流、浸漬30 min的方法考察，結(jié)果表明超聲與回流提取效果相當(dāng)，均好于浸漬，考慮到超聲操作便捷，故采用超聲方法。考察水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇超聲提取30 min，結(jié)果表明水的提取效果最佳，這與范曉紅等的研究[7]基本一致。

超聲15、30、45 min，考察超聲時間對試驗的影響，結(jié)果表明提取時間在15 min時提取不夠充分，而當(dāng)提取時間延長至45 min時與30 min并無顯著差異。故選擇超聲時間為30 min。

本試驗所采用的大黃末來自2個獸藥企業(yè)7批次樣品，不同批次大黃末樣品中沒食子酸的含量存在一定差異。但因采用的大黃藥材受炮制加工[8]等因素影響較大，要制訂含量限度尚需進(jìn)行收集大量樣品進(jìn)一步研究。

結(jié)果表明，在該薄層色譜條件下，沒食子酸的薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離度好；在該液相色譜條件下，沒食子酸峰與相鄰組分峰的分離度好，該方法的精密度、重復(fù)性、回收率試驗均符合規(guī)定，操作簡便、快速，可作為制定大黃末質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的參考依據(jù)。

[1] 中國獸藥典委員會. 中國獸藥典二O一O年版二部[S].[2] 中國獸藥典委員會. 獸藥使用指南中藥卷二O一O年版 [S].[3] 匡海學(xué). 中藥化學(xué)[M]. 北京: 中國中醫(yī)藥出版社, 2003:94.

[4] 王云, 李麗, 張村, 等. 大黃5種飲片沒食子酸和兒茶素的含量比較影響[J]. 中國中藥雜志, 2010, 35 (17):2267-2269.

[5] 沈華, 王正, 李蕾, 等. HPLC法同時測定沒食子提取物中沒食子酸、沒食子酸甲酯和沒食子酸乙酯的含量[J]. 齊魯藥事, 2014, 33(11):631-632.

[6] 張朔生. HPLC測定炮制前后石榴皮中沒食子酸的含量[J]. 藥物分析雜志, 2010, 30(6):1104-1106.

[7] 范曉紅, 李治建, 斯拉甫﹒艾白, 等. 沒食子中沒食子酸含量測定及總鞣質(zhì)提取方法的研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2011, 22(5):1119-1121.

[8] 雷鵬, 李新中, 朱詩塔, 等. 不同炮制方法對大黃中沒食子酸含量的影響[J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2008, 19(6):477-479.

(編輯：陳希)

Study on the Determination and Identified of Gallic Acid in Rhubarb Powder

Cai Wen-jin, Bao Ai-qing, Lu Chun-bo

(ZhejiangProvinceInstituteofveterinaryDrugandFeedstuff,Hangzhou310012,China)

To perfect the quality control method of rhubarb powder. Gallic acid was identified by thin layer chromatography (TLC) and determined by high performance liquid chromatography (HPLC). A chromatographic column of Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm ×4.6 mm, 5 μm) was used, with the mobile phase of methanol - 0.05% phosphoric acid solution (5∶95) at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was at 271 nm. The calibration curves were linear in ranges of 1.064～106.4 μg/mL(r= 1.0000)for gallic acid; the average recoveries (n=6) was 97.84%(RSD=0.61%). The method is accurate and sensitive for the quality control of rhubarb powder.

rhubarb powder; gallic acid; TLC; HPLC

蔡文金，女，助理獸醫(yī)師，從事中獸藥檢驗和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作。E-mail:lucb02@163.com

2015-09-06

A

1002-1280 (2016) 01-0052-04

S853.7