朱真，萬建青，楊挺英，康凱

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

改良Frey氏液體培養(yǎng)基質(zhì)控菌株菌種代次與生長曲線研究

朱真，萬建青*，楊挺英，康凱

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

為探究改良Frey氏液體培養(yǎng)基質(zhì)控菌CVCC2960滑液支原體(以下簡稱MS)生長規(guī)律，本試驗(yàn)首次同時(shí)采用CFU計(jì)數(shù)、CCU測定和pH值測定的方法，比較不同接種濃度、接種體積和不同代次MS生長情況。結(jié)果顯示：5%與10%接種量的CCU測定結(jié)果峰值差異不明顯，但5%接種的CFU計(jì)數(shù)峰值更高，pH下降更慢；1～5代菌在生長曲線各階段的測定結(jié)果均無明顯差別；3種不同接種方式的測定結(jié)果顯示，用0.5 mL菌液接種9.5 mL培養(yǎng)基的方式更利于MS生長。本試驗(yàn)為改良Frey氏液體培養(yǎng)基的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)化提供依據(jù)。

滑液支原體；培養(yǎng)基質(zhì)控；菌種代次；傳代

支原體污染是生物制品常見的污染源，給科研、疫苗生產(chǎn)及生物制品產(chǎn)業(yè)帶來許多麻煩，《美國藥典》、《歐洲藥典》及《中國獸藥典》二〇一〇年版三部中均有使用培養(yǎng)法進(jìn)行生物制品支原體檢查的專題論述[1-3]，《中國獸藥典》二〇一〇年版三部規(guī)定滑液支原體、豬鼻支原體分別為支原體檢驗(yàn)用培養(yǎng)基支原體改良Frey氏培養(yǎng)基、支原體培養(yǎng)基質(zhì)控菌株[3]。通過測定不同培養(yǎng)時(shí)段的CCU，繪制出的MS生長曲線表明：其遲緩期為培養(yǎng)后6 h內(nèi)，對(duì)數(shù)期為6～36 h，穩(wěn)定期為 36～54 h，衰老期為54 h之后[4]。而通過測定不同培養(yǎng)時(shí)段的CCU可以發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)過程中活菌濃度上升伴隨著pH值的降低，且pH值為6.9時(shí)濃度達(dá)到最高[5],但同時(shí)用以上三種方法對(duì)滑液支原體進(jìn)行生長曲線研究國內(nèi)尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)合CFU計(jì)數(shù)法、CCU測定法和pH值測定法，以活菌濃度、生長滴度和菌液pH值為指標(biāo)，比較不同接種濃度、體積和不同代次MS生長情況，對(duì)該MS生長特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，以期為改良Frey氏液體培養(yǎng)基質(zhì)控工作的標(biāo)準(zhǔn)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 滑液支原體(CVCC2960)，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 改良Frey氏液體培養(yǎng)基、改良Frey氏固體培養(yǎng)基，均由北京中海生物科技有限公司提供。

1.1.3 儀器 生物安全柜，NUAIRE公司；CO2培養(yǎng)箱，SANYO公司；恒溫培養(yǎng)箱，SANYO公司；pH計(jì)，METTLER TOLEDO公司；渦旋震蕩器，北京金紫光科技發(fā)展有限公司；冰箱，海爾公司。

1.2 方法

1.2.1 不同接種濃度和收獲時(shí)間差異比較1.2.1.1 菌液制備 將MS凍干菌株啟開，用改良Frey氏液體培養(yǎng)基恢復(fù)原體積，再以10%比例接種至改良Frey氏液體培養(yǎng)基中，35～37 ℃培養(yǎng)24 h后，再按5%比例傳1代，然后分別按5%(將1 mL菌液加至19 mL改良Frey氏液體培養(yǎng)基中)和10%(將2 mL菌液加至18 mL改良Frey氏液體培養(yǎng)基中)兩種比例進(jìn)行連續(xù)傳代，選擇2代菌作為工作菌液。

1.2.2 不同菌種代次差異比較

1.2.2.1 菌液制備 將MS凍干菌株啟開，用改良Frey氏液體培養(yǎng)基恢復(fù)原體積，按5%比例接種至改良Frey氏液體培養(yǎng)基中，35 ～37 ℃培養(yǎng)24 h后，再按5%比例，將1 mL菌液加至19 mL支原體液體培養(yǎng)基中，以同樣方式，連續(xù)傳至5代，分別選擇1～5代菌作為工作菌液。

1.2.2.2 活菌計(jì)數(shù) 分別選擇1～5代菌菌液，用“1.2.1.2”中所提及的方法，分別對(duì)各代次培養(yǎng)的0、6、18、24、30、34、40 h進(jìn)行CCU測定，分別從每代的各時(shí)間節(jié)點(diǎn)選取2個(gè)樣本，同時(shí)對(duì)1～5代MS生長滴度變化進(jìn)行比較。

1.2.3 不同傳代體積差異 比較取2代MS工作菌株，5%比例接種至改良Frey氏液體培養(yǎng)基中，35～37 ℃培養(yǎng)24 h后，再按5%比例，分別選擇3種不同培養(yǎng)體積傳代，一種方式是使用小試管將0.1 mL菌液加至1.9 mL支原體液體培養(yǎng)基中，一種是使用小試管將0.2 mL菌液加至3.8 mL培養(yǎng)基，另一種則是使用細(xì)胞培養(yǎng)瓶將0.5 mL菌液加至9.5 mL培養(yǎng)基，35～37 ℃培養(yǎng)24 h后，用“1.2.1.2”中所提及的方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)(CFU計(jì)數(shù)法)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種濃度和收獲時(shí)間差異比較2.1.1 不同接種濃度活菌濃度和pH值的比較 兩種濃度接種的MS各時(shí)間點(diǎn)的活菌濃度、生長滴度和pH值如表1、表2所示。從表1可以看出，5%濃度接種的MS接種后24 h 活菌濃度達(dá)到峰值；生長滴度18 h達(dá)到峰值；菌液pH則持續(xù)下降，18～24 h降至7.0以下。從表2可以看出，10%濃度接種的MS活菌濃度24 h達(dá)到峰值；生長滴度18 h達(dá)到峰值；菌液pH持續(xù)下降，18～24 h降至7.0以下。

表1 5%濃度接種滑液支原體各時(shí)刻生長情況表

表2 10%濃度接種滑液支原體各時(shí)刻生長情況表

2.1.2 不同接種濃度生長曲線和pH值變化比較 兩種接種濃度MS生長曲線和pH值變化情況見圖1～圖3。從圖1可以看出，接種濃度5%的MS 6～18 h活菌濃度增長更快，18～30 h活菌濃度更高；從圖2可以看出，接種濃度10%的MS 18～24 h生長滴度更高，24～40 h生長滴度下降更快；從圖3可以看出，同為pH持續(xù)下降的情況下，10%下降更快。

2.2 滑液支原體1～5代菌生長滴度比較 1～5代菌0～40 h各時(shí)間生長滴度見表3，F(xiàn)1～F5分別表示1～5代菌，其生長滴度變化范圍從低代至高代依次為(105～108)、(106～5.5×108)、(106～109)、(106～5.5×108)、(106～109)CCU/mL、通過比較1～5代MS生長滴度差異(表4、圖4)，可以看出1～5代菌峰值均不小于1.00 × 108CCU/mL，其中，F(xiàn)3、F5峰值達(dá)1.00 × 109CCU/mL，1～5代菌生長滴度不小于1.00 × 108CCU/mL的生長時(shí)間區(qū)段重疊部分為24～30 h。

圖2 不同接種濃度滑液支原體生長曲線圖(生長滴度CCU測定法)

圖3 不同接種濃度滑液支原體pH值變化圖

圖4 1～5代菌生長滴度的對(duì)數(shù)圖

時(shí)間/hF1(CCU·mL-1)F2(CCU·mL-1)F3(CCU·mL-1)F4(CCU·mL-1)F5(CCU·mL-1)05.05×1055.50×1061.00×1061.00×1061.00×10661.00×1051.00×1061.00×1061.00×1065.50×106185.50×1075.50×1081.00×1085.50×1081.00×109241.00×1081.00×1081.00×1091.00×1085.50×108301.00×1081.00×1085.50×1081.00×1081.00×108345.50×1075.50×1061.00×1085.50×1075.50×106401.00×1075.05×1045.50×1071.00×1061.00×105

表4 1～5代菌生長滴度差異比較表

2.3 不同傳代體積差異比較 從表5可以看出兩種傳代體積MS不同生長情況，在菌液濃度樣本重復(fù)次數(shù)相同(n=4)的情況下，3組傳代方式的MS平均活菌濃度依次為(6.6±2.1)×107、(5.6±0.4)×107、(13.3±2.5)×107CFU/mL。對(duì)3組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，利用最小顯著差數(shù)法(LSD法)對(duì)3組平均值進(jìn)行多重比較，結(jié)果顯示：組1和組2無顯著差異，組3分別和組1、組2之間存在極顯著差異(P<0.01)，就MS活菌濃度而言，組3傳代方式優(yōu)于組1、組2，即用0.5 mL菌液接種9.5 mL培養(yǎng)基的方式更利于MS生長。

表5 不同傳代體積滑液支原體活菌濃度表

注：用LSD法進(jìn)行多重比較，同列標(biāo)有不同大寫字母A、B者表示組間差異極顯著(P<0.01)，即組3與組1、組2組間差異極顯著；標(biāo)有不同小寫字母a、b者表示組間差異顯著(P<0.05)，即組3與組1、組2組間差異顯著，標(biāo)有相同小寫字母b者表示組間差異不顯著(P>0.05)，即組1、組2組間差異不顯著

3 討論與小結(jié)

3.1 傳代比例菌種傳代是常用的微生物試驗(yàn)技術(shù)之一，細(xì)菌及支原體常用的傳代比例通常為10%，魏順在MS培養(yǎng)時(shí)，先將菌株復(fù)蘇，再以1∶9比例接種，通過肉眼判斷，當(dāng)培養(yǎng)基由紅色變?yōu)槌壬蚍狐S色時(shí)收獲[6]，劉軼秋等則是將-20 ℃凍存的MS恢復(fù)原體積后，再按5%比例接種[4]。本試驗(yàn)比較了5%與10%傳代比例的生長曲線，從結(jié)果來看，5%與10%兩種比例接種的MS，活菌濃度與生長滴度均呈先升高后降低的趨勢，二者活菌濃度峰值均出現(xiàn)在24 h，而生長滴度的峰值是18 h，二者生長滴度不小于108CCU/mL時(shí)間區(qū)段均為18～24 h，生長滴度峰值均差異不明顯，但傳代濃度5%與10%相比有兩點(diǎn)優(yōu)勢，一是傳代比例下峰值活菌濃度高，前者近乎于后者2倍，差異明顯；二是5%傳代比10%傳代pH值下降慢，即比較同時(shí)間點(diǎn)pH值，5%傳代比例比10%傳代比例高，MS是一類對(duì)pH值較敏感的微生物，pH值低于6.8時(shí)極易死亡[7]，基于活菌濃度和pH值綜合考慮，建議在改良Frey氏培養(yǎng)基日常檢驗(yàn)中，MS復(fù)蘇后，將5%作為傳代比例。

3.2 收獲時(shí)間《中國獸藥典》規(guī)定，改良Frey氏培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)最小變色單位不小于108[3]，在日常檢驗(yàn)中，為保證檢驗(yàn)結(jié)果真實(shí)、客觀、有效，所使用工作菌液生長活性不能過高或過低，過高導(dǎo)致培養(yǎng)基檢驗(yàn)敏感性低，過低則使敏感性高。選擇接種濃度為5%，培養(yǎng)18～24 h，生長滴度維持在108CFU/mL與109CFU/mL之間，理論上，可以在18～24 h內(nèi)收獲菌液。每次試驗(yàn)的菌種、環(huán)境、操作不盡相同，具體的收獲時(shí)機(jī)需要依賴pH值測定，周錦龍等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值為6.9的時(shí)候，活菌濃度達(dá)到最高[5]，從本次試驗(yàn)來看，pH值為6.95時(shí)為菌液發(fā)生變色的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。基于以上綜合分析，建議菌液培養(yǎng)18～24 h內(nèi)，菌液即將發(fā)生變色之時(shí)收獲。3.3 菌種代次為保證檢驗(yàn)過程中菌種均一、一致，《中國獸藥典》規(guī)定改良Frey氏液體培養(yǎng)基質(zhì)控菌MS傳代不可超過5代[3]，鑒于此，本次試驗(yàn)只針對(duì)1～5代菌進(jìn)行比較。從結(jié)果來看， 1～5代菌生長滴度不小于108CFU/mL,收獲時(shí)間段基本重疊于18～30 h(1代略顯遲滯)，但峰值會(huì)隨著代次增加而略有抬升，因?yàn)殡S著傳代次數(shù)增加，支原體對(duì)培養(yǎng)基適應(yīng)性更強(qiáng)，生長更好。通過分析，1～5代菌均可用作培養(yǎng)基質(zhì)控菌工作菌液，但在實(shí)際工作中，可綜合考慮凍存菌種代次、保存時(shí)間等影響種子菌液活性的客觀因素，再科學(xué)確定工作菌液代次。

3.4 傳代體積傳代體積是培養(yǎng)基檢驗(yàn)、生物制品生產(chǎn)等過程中一項(xiàng)重要技術(shù)參數(shù)，杜德艷等通過測定豬肺炎支原體在不同容積培養(yǎng)瓶中CCU值和pH變化值得出，菌種在小容量瓶培養(yǎng)與在萬瓶培養(yǎng)相比，生長更快，CCU值亦更高[8]，由于在改良Frey氏培養(yǎng)基日常檢驗(yàn)中，所需要菌液量較少，故本試驗(yàn)選取了3組菌液與培養(yǎng)基體積搭配。通過比較分析， “0.5 mL菌液+9.5 mL培養(yǎng)基”的傳代方式優(yōu)于“0.1 mL菌液+1.9 mL培養(yǎng)基”和“0.2 mL菌液+3.8 mL培養(yǎng)基”，具有極顯著差異，而后兩者間無顯著差異，故在改良Frey氏培養(yǎng)基日常檢驗(yàn)中，建議使用“0.5 mL菌液+9.5 mL培養(yǎng)基”的傳代方式。

本試驗(yàn)首次結(jié)合CFU計(jì)數(shù)法、CCU測定法以及pH值測定法，通過活菌計(jì)數(shù)和pH值測定，確定了MS體適宜傳代比例、收獲時(shí)間、菌種代次以及傳代體積，為改良Frey氏液體培養(yǎng)基的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)化提供依據(jù)。

[1] The United States Phamacopeial Convention, Inc. USP36NF31, General Chapter 63, Mycoplasma Tests[S].

[2] European Directorate for the Quality of Medicines & Healthcare, Councile of Europe. European Phamacopoeia 5.0, 2.6.7Mycoplasmas[S].

[3] 中國獸藥典委員會(huì). 中國人民共和國獸藥典二〇一〇年版三部[S].

[4] 劉軼秋, 丁家波, 李蓓蓓, 等. 支原體檢驗(yàn)用培養(yǎng)基質(zhì)控菌株的生長曲線與世代時(shí)間測定[J]. 中國獸藥雜志, 2012, 46(12): 13-15.

[5] 周錦龍, 封柯宇, 吳波良, 等. 禽滑液支原體液體培養(yǎng)中pH與活菌濃度關(guān)系研究[A]. 動(dòng)物微生態(tài)學(xué)分會(huì)第四屆第十一次全國學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C]．2014.

[6] 魏順. 衣阿華支原體與滑液支原體的全基因組測序及分析[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[7] 吳移謀, 葉元康. 支原體學(xué)[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2008.

[8] 杜德燕, 張洪, 姜來生, 等. 不同容積的培養(yǎng)瓶對(duì)豬肺炎支原體培養(yǎng)滴度的影響[J]. 四川畜牧獸醫(yī), 2013，(6): 29-31.

(編輯：侯向輝)

Study on the Generation and Growth Curve of Modified Frey Liquid Culture Medium Quality Control Strains

ZHU Zhen，WAN Jian-qing*，YANG Ting-ying，KANG Kai

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl，Beijing100081，China)

To explore the growth law of a quality control strain for modified Frey liquid medium, CVCC2960MycoplasmaSynoviae(MS), the colony counting method, CCU assay and pH determination were combined to compare MS growth in different inoculation concentrations, inoculation volumes and generations. The results indicated that there was no significant difference in growing titer peak, while 5% strains had a higher living cell concentration peak and a slower decrease pH value. The generation and growth value of 1～5 generations didn’t have significant difference. That mix 0.5 mL bacteria suspension with 9.5 mL medium was proved to be more suitable than other two for MS. This study provided a basis evidence of standardization for modified Frey liquid medium.

MycoplasmaSynoviae(MS); medium quality control; strains generation; passage cultured

朱真，研究實(shí)習(xí)員,從事培養(yǎng)基等原材料的質(zhì)控工作。

2015-11-13

A

1002-1280 (2016) 01-0014-05

S852.61