李丹,張玉潔,孫志文,王鶴佳,李倩,仲鋒*

(1、中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2、北京市獸藥監(jiān)察所，北京102629)

高效液相色譜法測(cè)定羊奶中五種氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留量的研究

李丹1,張玉潔1,孫志文2,王鶴佳1,李倩1,仲鋒1*

(1、中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2、北京市獸藥監(jiān)察所，北京102629)

建立了一種可同時(shí)檢測(cè)羊奶中五種氟喹諾酮類(lèi)藥物(環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星)殘留的高效液相色譜—熒光檢測(cè)法。羊奶樣品經(jīng)乙腈提取，正己烷去脂肪，C18柱凈化。以0.05 mol/L磷酸三乙胺溶液和乙腈溶液為流動(dòng)相，流速為0.8 mL/min，激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm。結(jié)果表明環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星在10～200 ng/mL，達(dá)氟沙星在2～40 ng/mL呈良好的線性關(guān)系，R2均大于0.999。環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星的最低定量限為30 μg/kg，達(dá)氟沙星的最低定量限為6 μg/kg。環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星在30～200 μg/kg的濃度添加水平上，達(dá)氟沙星在6～40 μg/kg的濃度添加水平上其回收率均在70～100 %，批內(nèi)、批間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20 %。該方法簡(jiǎn)單快速、靈敏度高、重復(fù)性好，適用于羊奶中五種氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留檢測(cè)。

高效液相色譜法；氟喹諾酮類(lèi)藥物；殘留；羊奶

環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星均屬于氟喹諾酮類(lèi)抗菌藥物，該類(lèi)藥物具有高效、廣譜、低毒等特點(diǎn)，在畜牧業(yè)養(yǎng)殖業(yè)中廣泛用于預(yù)防與治療動(dòng)物疾病[1]。隨著喹諾酮類(lèi)藥物在人醫(yī)和獸醫(yī)應(yīng)用的增加，其各種毒副作用也逐漸顯現(xiàn)出來(lái)，美國(guó)自20世紀(jì)80年代中期至今已使用1億人次以上，氟喹諾酮類(lèi)藥物的嚴(yán)重不良反應(yīng)年發(fā)生率約1/3500。日本對(duì)氟喹諾酮的開(kāi)發(fā)研究中，副作用發(fā)生率為1.6%～4.8%[2]。因此通過(guò)有效的技術(shù)手段，對(duì)動(dòng)物性食品中的有關(guān)氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留進(jìn)行檢測(cè)，以確保人類(lèi)對(duì)動(dòng)物性食品消費(fèi)的安全，具有十分重要的意義。為加強(qiáng)獸藥殘留監(jiān)控工作，保證動(dòng)物性食品衛(wèi)生安全，農(nóng)業(yè)部于2002年發(fā)布第235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定達(dá)氟沙星在羊奶中的最高殘留限量(MRL)為30 μg/kg；恩諾沙星和環(huán)丙沙星在羊奶中的最高殘留限量(MRL)為100 μg/kg[3]。

目前，有關(guān)FQs多殘留在動(dòng)物組織中的檢測(cè)方法，國(guó)內(nèi)外已有諸多報(bào)道。主要是通過(guò)高效液相色譜法，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法及熒光檢測(cè)器檢測(cè)[4-6]，但是采用高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)羊奶中環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星殘留的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在建立一種操作步驟簡(jiǎn)單，并可滿(mǎn)足同時(shí)檢測(cè)羊奶中五種氟喹諾酮類(lèi)藥物的多殘留分析方法。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品、主要試劑及其配制 環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、二氟沙星對(duì)照品,中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量≥99.0%；沙拉沙星對(duì)照品,中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量≥95.0%。乙腈(色譜純)、正己烷(色譜純)、正丙醇(色譜純),美國(guó)Fisher公司；磷酸二氫鉀(分析純)、磷酸(分析純)、三乙胺(分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；C18固相萃取柱：100 mg/mL；水,美國(guó)Millipore超純水儀制備，符合GB/T 6682-1992規(guī)定的一級(jí)水。

環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱(chēng)取環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星對(duì)照品約50 mg，達(dá)氟沙星約10 mg,精密稱(chēng)定，于50 mL量瓶中，用0.03 mol/L氫氧化鈉溶解并稀釋成含達(dá)氟沙星0.2 mg/mL、含環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈溶解并稀釋成濃度為2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液(達(dá)氟沙星濃度為0.4 μg/mL)。

1.2 主要儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀(配熒光檢測(cè)器)美國(guó)安捷倫公司；AE 240型分析天平； Biofuge Stratos高速冷凍離心機(jī)德國(guó)賀利氏公司；IKEA渦動(dòng)混合儀；IKA-WERKE振蕩器。

1.3 方法

1.3.1 樣品的提取 稱(chēng)取(2±0.05) g試料，置50 mL離心管中，乙腈5 mL，正己烷8 mL，渦旋混勻，中速振蕩5 min，10000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入50 mL雞心瓶中，殘?jiān)儆靡译? mL提取一遍，合并兩次提取液，加正丙醇3 mL，于55 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加pH7.0磷酸鹽緩沖液10 mL溶解，備用。

1.3.2 樣品的凈化 C18柱用甲醇2 mL、水2 mL預(yù)洗。取備用液3.0 mL過(guò)柱，用水1 mL洗，擠干。流動(dòng)相1.0 mL洗脫，混勻，過(guò)濾膜，供高效液相色譜法測(cè)定。

1.3.3 色譜操作條件及參數(shù) 色譜柱: Hypersil C18(250 mm×4.6 mm,i.d )，粒徑5 μm，或相當(dāng)者；流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸三乙胺溶液—乙腈液(82∶18,v/v)；流速: 0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng): 激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm；柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量: 20 μL。1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確量取適量的環(huán)丙沙星等五種標(biāo)準(zhǔn)工作液，用流動(dòng)相稀釋成含環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星濃度分別為10、20、60、100、150、200 ng/mL，達(dá)氟沙星濃度分別為2、4、12、20、30、40 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣分析繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.3.5 回收率及精密度的測(cè)定 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，稱(chēng)取羊奶樣品，置于50 mL離心管中，添加適宜濃度的環(huán)丙沙星等五種標(biāo)準(zhǔn)工作液，環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星在羊奶中的藥物濃度為30、100、200 ug/kg；達(dá)氟沙星在羊奶中的藥物濃度為6、20、40 ug/kg。每種濃度5個(gè)樣品，重復(fù)3批次，按照1.3.1和1.3.2的方法處理后，供HPLC測(cè)定，外標(biāo)法定量，計(jì)算回收率、批內(nèi)、批間變異系數(shù)。

1.3.6 檢測(cè)限和定量限的測(cè)定 對(duì)環(huán)丙沙星等五種標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)行HPLC分析，并逐漸降低濃度，以溶液檢測(cè)時(shí)的信噪比(S/N)分別大于等于3和10作為藥物的檢測(cè)限和定量限。并計(jì)算定量限濃度點(diǎn)的回收率及批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，驗(yàn)證其可靠性[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離 在優(yōu)化的色譜條件下，測(cè)得羊奶中環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星色譜峰峰形好，峰間隔時(shí)間較長(zhǎng)，且均達(dá)到基線分離?？瞻捉M織樣品在上述時(shí)間無(wú)干擾峰出現(xiàn)，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 羊奶中環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星的高效液相色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別以環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星的色譜峰面積與其對(duì)應(yīng)的對(duì)照溶液的質(zhì)量濃度作圖，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星在30～200 μg/kg的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，達(dá)氟沙星在6～40 μg/kg的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，色譜峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

表1 環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.3 樣品的回收率及精密度

表2 環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星在羊奶中的回收率(n=5)

由表2可以看出羊奶中環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星添加濃度水平分別為30、100、200 μg/kg時(shí)，平均回收率分別在70.8%～74.7%，88.6%～94.9%，74.5%～79.0%，81.4%～83.6%范圍內(nèi)，批內(nèi)、批間的RSD分別低于5.98%、6.29%；8.08%、9.69%；9.68%、10.7%；10.2%、10.8%；達(dá)氟沙星添加濃度水平分別為6、20、40 μg/kg時(shí)，平均回收率分別在71.1%～83.2%范圍內(nèi)，批內(nèi)、批間的RSD分別低于9.90%、9.93%。結(jié)果表明該方法可靠，重復(fù)性高。

2.4 靈敏度 應(yīng)用本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法，測(cè)得羊奶中環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星的檢測(cè)限、定量限分別為9 μg/kg(S/N≥3)、30 μg/kg(S/N≥10)，達(dá)氟沙星的檢測(cè)限、定量限分別為1.8 μg/kg(S/N≥3)、6 μg/kg(S/N≥10)。由表2可見(jiàn)，添加濃度為30 μg/kg時(shí)，環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星(添加濃度為6 μg/kg)、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星在羊奶中的平均回收率均大于71.1 %，批內(nèi)、批間的RSD分別低于10.2%、10.8%。表明該方法在定量限水平的可靠性好，且靈敏度高，完全滿(mǎn)足環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星在羊奶中殘留檢測(cè)的需要。

3 討論與小結(jié)

3.1 色譜條件的選擇 參考國(guó)內(nèi)外有關(guān)資料，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)摸索，氟喹諾酮類(lèi)藥物在酸性條件下，具有較強(qiáng)的熒光吸收。因此，確立用高效液相色譜儀熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm；發(fā)射波長(zhǎng)為450 nm；流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸/三乙胺—乙腈液。為達(dá)到分離度要求，在試驗(yàn)過(guò)程中調(diào)整流動(dòng)相中有機(jī)相濃度比例，最后確立0.05 mol/L磷酸/三乙胺—乙腈液(82∶18)等度洗脫。

3.2 樣品提取與凈化方法的優(yōu)化 在方法的提取研究過(guò)程中，對(duì)樣品的提取液進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)摸索，采用酸性乙腈、堿性乙腈及純乙腈溶液進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純乙腈提取效果非常理想，對(duì)不同濃度的添加實(shí)驗(yàn)其回收率均高于70%，達(dá)到了殘留檢測(cè)的要求，因此，確立乙腈作為提取液。在去脂過(guò)程中，對(duì)正己烷、異辛烷的去脂效果進(jìn)行了對(duì)比研究，結(jié)果表明正己烷的去脂效果優(yōu)于異辛烷，同時(shí)對(duì)于正己烷的用量進(jìn)行了優(yōu)化選擇，結(jié)果表明8 mL正己烷的加入去脂效果最好。此外，在樣品提取過(guò)程中，對(duì)離心機(jī)使用的轉(zhuǎn)速和時(shí)間進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩次離心過(guò)程中，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為10000 r/min，離心時(shí)間為10 min的樣品除雜效果明顯優(yōu)于離心機(jī)轉(zhuǎn)速為10000 r/min，離心時(shí)間為5 min及轉(zhuǎn)速為5000 r/min，離心時(shí)間為5 min或10 min。

在方法的凈化研究過(guò)程中，提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干后，用流動(dòng)相溶解，過(guò)濾膜直接進(jìn)樣分析，發(fā)現(xiàn)樣品基質(zhì)干擾特別嚴(yán)重，達(dá)不到基本分離的要求，因此確定采用固相萃取技術(shù)進(jìn)行樣品的凈化。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)HLB，C18等固相萃取柱及不同柱規(guī)格進(jìn)行了摸索和比較研究，最終發(fā)現(xiàn)C18，100 mg/mL規(guī)格的萃取柱對(duì)樣品的凈化效果最好，最大程度地降低了樣品基質(zhì)對(duì)有效成分的干擾，使得環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星在羊奶中的殘留檢測(cè)技術(shù)參數(shù)(靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度)均達(dá)到了獸藥殘留檢測(cè)方法的要求。

3.3 方法的回收率及靈敏度 本試驗(yàn)中環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星的添加濃度范圍為30～200 μg/kg時(shí)，回收率在70.8%～94.9%范圍內(nèi)，批內(nèi)和批間RSD分別低于10.2%、10.8%，達(dá)氟沙星的添加濃度范圍為6～40 μg/kg時(shí)，回收率在71.1%～83.2%范圍內(nèi)，批內(nèi)和批間RSD分別低于9.90%、9.93%，符合農(nóng)業(yè)部對(duì)獸藥殘留試驗(yàn)規(guī)范中的要求[8]。通過(guò)添加定量限濃度點(diǎn)對(duì)其可靠性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星在羊奶中的回收率均大于71.1%，批內(nèi)、批間的RSD分別低于10.2%、10.8%。表明該方法在定量限水平的可靠性好，且靈敏度高，完全滿(mǎn)足環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星在羊奶中殘留檢測(cè)的需要。

本研究建立了一種同時(shí)檢測(cè)羊奶中五種氟喹諾酮類(lèi)藥物的多殘留分析方法。本試驗(yàn)條件下，表明該方法靈敏可靠，完全滿(mǎn)足羊奶中環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星的殘留檢測(cè)要求。

[1] 陳杖榴. 獸醫(yī)藥理學(xué)(第二版) [M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002: 282.

[2] 吳永寧，邵兵，沈建忠.獸藥殘留檢測(cè)與監(jiān)控技術(shù)[M].北京，化學(xué)工業(yè)出版社，2007:402.

[3] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量[S].

[4] 董志遠(yuǎn)，趙曉鳳，宮秀杰等. 牛奶中氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留量檢測(cè)方法研究[J]. 北京：中國(guó)獸藥雜志，2008(10): 14-16.

[5] 孫雷，朱馨樂(lè)，張?bào)P,等. 牛奶中七種氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留檢測(cè)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究[J]. 北京：中國(guó)獸藥雜志，2008(11): 16-19.

[6] 李丹，張玉潔，仲鋒等. 雞蛋中氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留量檢測(cè)方法研究[J]. 北京：中國(guó)獸藥雜志，2010(6): 1-4.

[7] 李俊鎖，邱月明，王超.獸藥殘留分析[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2002:40.

[8] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.關(guān)于發(fā)布《獸藥殘留試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范(試行)》的通知[S].

(編輯：陳希)

Study on Detection Method Quinolones Residues in Sheep Milk by HPLC

LI Dan1, ZHANG Yu-jie1, SUN Zhi-wen2, WANG He-jia1, LI Qian1, ZHONG Feng1*

(1.ChinaInstituteofVerterinaryDrugControl，Beijing，100081;2.BeijingveterinarydrugmonitoringInstitute，Beijing，102629)

A method for determination of quinolones residues in sheep milk with HPLC by FLD detection was established. Ciprofloxacin、danofloxacin 、enrofloxacin、sarafloxacin and difloxacin were extracted from sheep milk with acetonitrile and degreased in hexane, dissolved with pH7.0 phosphate solution after evaporation, then the solution was purified with C18 column. The mobile phase were 0.05 mol/L triethylammonium phosphate solution and acetonitrile, the flow rate was 0.8 mL/min .Fluorescence detection was carried out at excitation and emission wavelengths of 280 nm and 450 nm . A good linearity of the calibration curve was obtained with the range of 10～200 ng/mL for ciprofloxacin、enrofloxacin、sarafloxacin and difloxacin, and 2～40 ng/mL for danofloxacin(R2>0.999). The limit of quantification of ciprofloxacin、enrofloxacin、sarafloxacin and difloxacin was 30 μg/kg, and danofloxacin was 6 μg/kg. The average recoveries of quinolones residues from spiked sheep milk at the three concentrations of 30、100、200 μg/kg(ciprofloxacin、enrofloxacin、sarafloxacin and difloxacin)and 6、20、40 μg/kg(danofloxacin)ranged from 70-100 %(n=5) respectively. In day-between days batch variation coefficients were both less than 20 %.This method can be applied for the determination of quinolones residues in sheep milk.

HPLC；quinolones ；residues；sheep milk

李丹，碩士，從事獸藥殘留方法學(xué)研究及殘留檢測(cè)工作。

2015-12-02

A

1002-1280 (2016) 01-0031-05

S859.84