陳健, 王輝

(1聊城市中醫(yī)醫(yī)院,山東聊城252000;2南昌大學(xué)北區(qū)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

草魚魚鱗膠原蛋白對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖、周期及堿性磷酸酶水平的影響

陳健1, 王輝2

(1聊城市中醫(yī)醫(yī)院,山東聊城252000;2南昌大學(xué)北區(qū)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

目的 探討草魚魚鱗膠原蛋白對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖、周期及堿性磷酸酶(ALP)水平的影響。方法 將體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞株MC3T3-E1分為對(duì)照組和觀察組1～5組，每組5孔。觀察1～5 組加入用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的草魚魚鱗膠原蛋白溶液使膠原蛋白終濃度分別為50、100、200、 250、 300 mg/L，對(duì)照組細(xì)胞僅加等量RPMI1640培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。2 d后倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)；MTT法觀察各組細(xì)胞增殖情況(以O(shè)D值表示)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期分布；裂解各組細(xì)胞，收集上清液，用生化儀檢測(cè)ALP水平。結(jié)果 隨膠原蛋白濃度的增大，MC3T3-E1細(xì)胞生長(zhǎng)越來越旺盛，細(xì)胞越來越密集，細(xì)胞形態(tài)以多邊形為主，且單個(gè)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰可見。培養(yǎng)2 d后對(duì)照組和觀察1～5組細(xì)胞OD490值分別為0.521±0.010、0.548±0.021、0.605±0.007、0.612±0.013、0.627±0.020、0.685±0.018。觀察2～4組細(xì)胞OD490值均高于對(duì)照組和觀察1組(P均<0.05)，觀察5組細(xì)胞OD490值高于其余各組(P均<0.05)。從對(duì)照組到觀察5組，隨著草魚魚鱗膠原蛋白濃度的升高，S期MC3T3-E1細(xì)胞比例呈降低趨勢(shì)(P均<0.05)，G2/M期細(xì)胞比例呈升高趨勢(shì)(P均<0.05)，G0/G1期細(xì)胞比例變化趨勢(shì)不明顯。對(duì)照組和觀察1～5組細(xì)胞ALP水平分別為(14.50±0.55)、(13.33±0.52)、(13.33±1.03)、(14.67±0.82)、(14.67±0.82)、(14.67±0.52)U/L。觀察1、2組MC3T3-E1細(xì)胞ALP水平低于對(duì)照組(P均<0.05)，而觀察3、4、5組MC3T3-E1細(xì)胞ALP水平與對(duì)照組相比，P均>0.05。結(jié)論 草魚魚鱗膠原蛋白能促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖，促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T3-E1由S期進(jìn)入G2/M期，提高成骨細(xì)胞MC3T3-E1的ALP水平。

膠原蛋白；草魚；魚鱗；成骨細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期；堿性磷酸酶

膠原蛋白具有美白、保濕、防皺、修復(fù)、營(yíng)養(yǎng)、減肥等美容美體作用[1]，目前已廣泛的應(yīng)用于臨床止血、組織工程和藥物緩沖等方面[2,3]，但是在骨科應(yīng)用不多。2015年6～10月，我們觀察了草魚魚鱗膠原蛋白對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖、周期分布及堿性磷酸酶(ALP)水平的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 成骨細(xì)胞株MC3T3-E1，自制草魚魚鱗膠原蛋白(I型，電泳純)，胎牛血清(FBS)，胰蛋白酶，核糖核酸酶(RNase)，核因子-κB受體活化因子配基，RPMI1640 培養(yǎng)基(100 ng/mL)，PBS溶液，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，碘化丙啶(PI)，無血清MEM培養(yǎng)液，二甲基亞砜(DMSO)，24孔培養(yǎng)板，96孔培養(yǎng)板，HERAcell150二氧化碳培養(yǎng)箱，DNM-9602型酶標(biāo)儀，流式細(xì)胞儀。

1.2 MC3T3-E1細(xì)胞分組及草魚魚鱗膠原蛋白應(yīng)用 成骨細(xì)胞株MC3T3-E1在37 ℃恒溫恒濕、5 %CO2的培養(yǎng)箱中用RPMI1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每隔2～3 d傳代一次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，終止消化并離心，用含有10%FBS和核因子-κB受體活化因子配基的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。用RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液的密度調(diào)整至2.0×105/mL,然后接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入 90 μL 細(xì)胞懸液。設(shè)對(duì)照組和觀察1～5 組。觀察1～5 組加入用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的草魚魚鱗膠原蛋白溶液使膠原蛋白終濃度分別為50、100、200、 250、 300 mg/L，對(duì)照組細(xì)胞僅加等量RPMI-1640培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)2 d后檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 各組細(xì)胞形態(tài)觀察 培養(yǎng)2 d后，于倒置顯微鏡下各組MC3T3-E1、Raw264.7細(xì)胞形態(tài)。

1.4 各組細(xì)胞增殖觀察 采用MTT法[4]。培養(yǎng)2 d后加入5 mg/mL 的MTT每孔 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，除去上清液，每孔加入100 μL的DMSO 溶解呈色，輕微震蕩，在波長(zhǎng)490 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度OD值。

1.5 各組細(xì)胞周期檢測(cè)[5]各孔細(xì)胞用PBS洗滌3次，70%乙醇4 ℃固定，RNase 消化30 min，用50 mg/L碘化丙啶染色2 min，然后用流式細(xì)胞儀和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布。

1.6 各組細(xì)胞ALP水平檢測(cè)[6]每孔加1 mL細(xì)胞裂解液冰浴30 min，收集上清液用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALP。

2 結(jié)果

2.1 各組MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)比較 倒置相差顯微鏡下可見MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)為梭形、多邊形，細(xì)胞突觸長(zhǎng)，細(xì)胞間胞突相互連接，胞質(zhì)透明，細(xì)胞核較大。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞體積變大，多邊形細(xì)胞增多，核清晰，生長(zhǎng)旺盛。此外，隨膠原蛋白濃度的增大，MC3T3-E1細(xì)胞生長(zhǎng)越來越旺盛，細(xì)胞越來越密集，細(xì)胞形態(tài)以多邊形為主，且單個(gè)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰可見。

2.2 各組MC3T3-E1細(xì)胞OD490值比較 培養(yǎng)2 d后對(duì)照組和觀察1～5組MC3T3-E1細(xì)胞OD490值分別為0.521±0.010、0.548±0.0210、0.605±0.007、0.612±0.013、0.627±0.02、0.685±0.018。觀察2～4組MC3T3-E1細(xì)胞OD490值均高于對(duì)照組和觀察1組(P均<0.05)，觀察5組MC3T3-E1細(xì)胞OD490值高于其余各組(P均<0.05)。

2.3 各組MC3T3-E1細(xì)胞周期分布比較 各組MC3T3-E1細(xì)胞周期分布見表1。由表1可見，從對(duì)照組到觀察5組，隨著草魚魚鱗膠原蛋白濃度的升高，S期MC3T3-E1細(xì)胞比例呈降低趨勢(shì)(P均<0.05)，G2/M期細(xì)胞比例呈升高趨勢(shì)(P均<0.05)，G0/G1期細(xì)胞比例變化趨勢(shì)不明顯。

表1 各組MC3T3-E1細(xì)胞周期分布

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.4 各組MC3T3-E1細(xì)胞ALP水平比較 對(duì)照組和觀察1～5組MC3T3-E1細(xì)胞ALP水平分別為(14.50±0.55)、(13.33±0.52)、(13.33±1.03)、(14.67±0.82)、(14.67±0.82)、(14.67±0.52)U/L。觀察1、2組MC3T3-E1細(xì)胞ALP水平低于對(duì)照組(P均<0.05)，而觀察3、4、5組MC3T3-E1細(xì)胞ALP水平與對(duì)照組相比，P均>0.05。

3 討論

膠原蛋白是動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)。膠原是皮膚、骨、腱、軟骨、血管和牙齒的主要纖維成分，具有四級(jí)結(jié)構(gòu)，也是細(xì)胞骨架的重要成分[7，8]。骨中含有許多類型的膠原蛋白纖維，其中Ⅰ型膠原蛋白含量較多[9～11]，被認(rèn)為是基本骨基質(zhì)和成熟骨形成的必要條件[12～14]；骨中含量較少的膠原蛋白主要包括Ⅱ[15]、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅻ[16，17]和ⅩⅠⅤ以及ⅩⅩⅣ型[18]。膠原蛋白含量增加使機(jī)體組織器官的生物活性增強(qiáng)，尤其是可使骨組織韌性及骨量增加。此外，膠原含有極為豐富的羥脯氨酸和羥賴氨酸，來自于膠原的羥脯氨酸是將血漿中的鈣運(yùn)送到骨細(xì)胞的運(yùn)載工具。

成骨細(xì)胞是骨組織中的主要骨形成細(xì)胞，主要由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來，在骨合成代謝、軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨中起著核心作用。破骨細(xì)胞能夠通過直接表達(dá)和合成骨形成蛋白來促進(jìn)骨形成。骨膠原蛋白是骨的重要組分，是主要的鈣化作用細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在成骨細(xì)胞分化過程中也起到重要的作用[19]。骨中膠原蛋白合成增加或攝入膠原蛋白可使骨形態(tài)和骨微細(xì)結(jié)構(gòu)發(fā)生重要變化，使骨韌性增強(qiáng)，松質(zhì)骨中骨小梁變厚、硬度增大，有利于骨組織健康。

本研究結(jié)果顯示，不同濃度的草魚魚鱗膠原蛋白均能促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞聚集生長(zhǎng)，且隨著草魚魚鱗膠原蛋白濃度的提高，細(xì)胞生長(zhǎng)越來越旺盛，細(xì)胞形態(tài)圓而大，細(xì)胞核逐步變多，單個(gè)細(xì)胞形態(tài)清晰。說明草魚魚鱗膠原蛋白可能通過促進(jìn)成骨細(xì)胞數(shù)量增加發(fā)揮其成骨作用，從而進(jìn)一步提高骨組織韌性及骨量。

本研究結(jié)果顯示,不同濃度的草魚魚鱗膠原蛋白對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，且草魚魚鱗膠原蛋白濃度越高，MC3T3-E1細(xì)胞增殖越活躍，與上述研究結(jié)果相符。

本研究結(jié)果顯示，不同濃度的草魚魚鱗膠原蛋白對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞周期分布有影響。從對(duì)照組到觀察5組，隨著草魚魚鱗膠原蛋白濃度的升高，S期MC3T3-E1細(xì)胞比例呈降低趨勢(shì)(P均<0.05)，G2/M期MC3T3-E1細(xì)胞比例呈升高趨勢(shì)(P均<0.05)，G0/G1期MC3T3-E1細(xì)胞比例變化趨勢(shì)不明顯。筆者查閱文獻(xiàn)后認(rèn)為這可能是由于膠原蛋白上調(diào)MMP-2的表達(dá)，激活下游的轉(zhuǎn)錄因子Run-2表達(dá)，促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞由分裂前期向G2/M期分化。這種分化同時(shí)也促進(jìn)了細(xì)胞成骨的活性。

巨噬細(xì)胞在核因子-κB受體活化因子配體刺激下分化為破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的過程中，ALP是分化成熟的標(biāo)志。

[1] 裘炳毅.化妝品化學(xué)和工藝技術(shù)大全(上冊(cè))[Z].廣州:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1997:25-28.

[2] 夏有辰,牛星燾,李比,等.醫(yī)用美容膠原注射的臨床療效觀察[J].中國(guó)微創(chuàng)外科雜志,2004,11(4):224-225.

[3] 任俊莉,邱化玉,付麗紅.膠原蛋白及其在造紙工業(yè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)造紙學(xué)報(bào),2003,18(2):106-110.

[4] 王建舫,安亞蘭,張大丙,等.骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)小鼠成骨細(xì)胞中骨保護(hù)素和核因子-κB受體活化因子配體mRNA體外表達(dá)的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2009(12):24-26.

[5] 丁佩惠,唐琪,陳莉麗.柚皮苷對(duì)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖、分化和礦化的影響[J].中國(guó)中藥雜志,2009,34(13):1712-1716.

[6] 唐琪,陳莉麗,嚴(yán)杰.骨碎補(bǔ)提取物促小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1細(xì)胞增殖,分化和鈣化作用的研究[J].中國(guó)中藥雜志,2004,29(2):164-168.

[7] 周倩,羅志剛,何小維.膠原蛋白的應(yīng)用研究[J].現(xiàn)代食品科技,2008,24(3):286.

[8] 鄧呂紅,李偉力.角膜膠原蛋白研究進(jìn)展[J].國(guó)際眼科雜志,2008, 8(3):557-560.

[9] Leeming DJ, Henriksen K, Byrjalsen I, et al. Is bone quality associated with collagen age[J]. Osteop Int, 2009,20(9):1461-1470.

[10] Viguet-Carrin S, Garnero P, Delmas PD. The role of collagen in bone strength[J]. Osteop Int, 2006,17(3):319-336.

[11] Collier TA, Nash A, Birch HL, et al. Preferential sites for intramolecular glucosepane cross-link formation in type I collagen: A thermodynamic study[J]. Matrix Biol, 2015,48(3):78-88.

[12] Koch M, Laub F, Zhou P, et al. Collagen ⅩⅩⅣ, a vertebrate fibrillar collagen with structural features of invertebrate collagens Selective Expression In Developing Cornea And Bone[J]. Journal of Biological Chemistry, 2003,278(44):43236-43244.

[13] 王瀝浩, 王文慧, 郭詠昕, 等. 膠原蛋白功能概述[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014，34(3):150-156.

[14] Takeuchi Y, Suzawa M, Kikuchi T, et al. Differentiation and transforming growth factor-β receptor down-regulation by collagen-α2β1 integrin interaction is mediated by focal adhesion kinase and its downstream signals in murine osteoblastic cells[J]. J Biol Chem, 1997,272(46):29309-29316.

[15] Kumahashi N, Swrd P, Larsson S, et al. Type II collagen C2C epitope in human synovial fluid and serum after knee injury-associations with molecular and structural markers of injury[J]. Osteoarthritis and Cartilage, 2015,33(4).

[16] Li Y, Tang J, Hu Y. Dimethyl fumarate protection against collagen II degradation[J]. Biochemi Biophy Res Commun, 2014,454(2):257-261.

[17] Chiquet M, Birk DE, Bonnemann CG, et al. Collagen XII: Protecting bone and muscle integrity by organizing collagen fibrils[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2014,53(4):51-54.

[18] 陳星星,張興儒,李青松,等.膠原蛋白在眼科疾病方面的研究新進(jìn)展[J].國(guó)際眼科雜志,2015,15(10):1745-1748.

[19] Duran I, Csukasi F, Taylor SP, et al. Collagen duplicate genes of bone and cartilage participate during regeneration of zebrafish fin skeleton[J]. Gene Exp Patt, 2015,19(1):60-69.

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.030

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B

1002-266X(2016)47-0095-03

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