叢 波　綜述　張仲文　審校

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軟骨組織工程種子細(xì)胞源的研究進(jìn)展

叢 波綜述張仲文審校

【摘要】關(guān)節(jié)軟骨缺損的發(fā)病率較高，患者生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響，傳統(tǒng)治療方式療效不理想。組織工程技術(shù)在臨床應(yīng)用方面進(jìn)行了初步嘗試，為臨床軟骨缺損修復(fù)提供了新的思路與途徑?，F(xiàn)就組織工程種子細(xì)胞的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】軟骨；組織工程；種子細(xì)胞

關(guān)節(jié)軟骨沒(méi)有血管、神經(jīng)及淋巴組織，一旦損傷后自我修復(fù)能力十分有限［1］。軟骨損傷的發(fā)病率較高，在運(yùn)動(dòng)員等特殊人群中發(fā)病率更高，以往的關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)、微骨折術(shù)等手術(shù)方式效果并不理想［2］，術(shù)后軟骨缺損區(qū)尚無(wú)軟骨生成或僅能生成纖維軟骨，不能徹底修復(fù)軟骨缺損。自“組織工程”的概念問(wèn)世以來(lái)，學(xué)者們一直在嘗試用各種組織工程方法修復(fù)軟骨缺損，組織工程的研究范疇主要包括種子細(xì)胞、支架材料和細(xì)胞因子，然而，不同的種子細(xì)胞在表型和增殖能力等方面都有差異，種子細(xì)胞的選擇對(duì)組織工程的研究至關(guān)重要。筆者主要對(duì)軟骨組織工程種子細(xì)胞源的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1　取材要求及臨床應(yīng)用

組織工程的種子細(xì)胞源應(yīng)符合以下要求：（1）來(lái)源廣泛，取材方便；（2）增殖能力強(qiáng)；（3）表型穩(wěn)定；（4）與支架材料的黏附率高；（5）對(duì)供區(qū)的損傷小；（6）無(wú)明顯免疫排斥反應(yīng)，生物安全性高；（7）植入體內(nèi)后能有效地修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，并且有明確的遠(yuǎn)期療效。目前，軟骨組織工程技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用［3］，如軟骨細(xì)胞移植可應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)、氣管軟骨修復(fù)、耳廓的重建、骨不連的治療等領(lǐng)域；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可用于修復(fù)軟骨缺損，治療肌腱、韌帶、椎間盤(pán)、半月板等結(jié)締組織的損傷，還可防止關(guān)節(jié)軟骨的退行性變發(fā)生，將外源基因?qū)牍撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞可有效地表達(dá)，從而達(dá)到治療相應(yīng)疾病的目的。國(guó)外已初步對(duì)組織工程修復(fù)軟骨缺損進(jìn)行了探索，但缺乏大樣本及長(zhǎng)期隨訪研究，且對(duì)治療效果的評(píng)估缺乏統(tǒng)一的客觀標(biāo)準(zhǔn)［3］。在軟骨組織工程的應(yīng)用過(guò)程中，生物反應(yīng)器技術(shù)可使組織均勻混合，精確控制基質(zhì)的生成比例，有利于保持組織的活性，近年應(yīng)用較多的生物反應(yīng)器有機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器、微載體生物反應(yīng)器、灌注式生物反應(yīng)器、旋轉(zhuǎn)式微重力生物反應(yīng)器。

2　種類(lèi)

2.1軟骨細(xì)胞 軟骨細(xì)胞因取材方便、免疫排斥反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)是軟骨組織工程種子細(xì)胞的重要來(lái)源［4］。按照軟骨種子細(xì)胞的不同來(lái)源又可細(xì)分為自體軟骨細(xì)胞、異種軟骨細(xì)胞及同種異體軟骨細(xì)胞。因異種軟骨細(xì)胞雖來(lái)源廣泛，但免疫原性較強(qiáng)，應(yīng)用較少，故不作詳細(xì)論述。

2.1.1自體軟骨細(xì)胞 從患者體內(nèi)獲得軟骨組織后，可通過(guò)胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶獲得大量純度較高的自體軟骨細(xì)胞。有學(xué)者研究表明自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)修復(fù)軟骨缺損療效滿意，術(shù)后對(duì)新生軟骨行組織切片檢查證實(shí)新生軟骨為透明軟骨［5，6］。軟骨細(xì)胞來(lái)源于自體，不存在免疫排斥，但是自體軟骨細(xì)胞來(lái)源較為局限，增殖能力低下。膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的患者進(jìn)行軟骨細(xì)胞移植手術(shù)前，需從膝關(guān)節(jié)非負(fù)重區(qū)獲取健康的關(guān)節(jié)軟骨體外消化培養(yǎng)，這就增加了供區(qū)術(shù)后疼痛和骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率。在體外實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞傳至3代以后生長(zhǎng)緩慢，會(huì)失去原有的形狀，細(xì)胞表型發(fā)生改變，發(fā)生去分化。3代之前軟骨細(xì)胞特異性表達(dá)Ⅱ型膠原，3代以后轉(zhuǎn)為表達(dá)Ⅰ型和Ⅲ型膠原，蛋白多糖分泌減少，成軟骨能力減弱。隨著年齡增長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞活性逐漸下降，自體軟骨細(xì)胞移植不太適合年齡較大的患者，這也是自體軟骨細(xì)胞作為軟骨組織工程種子細(xì)胞的局限所在，然而軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過(guò)程中，接種密度較低容易發(fā)生去分化，而在接種密度高細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)就不存在這一問(wèn)題［7］。Robinson等［8］認(rèn)為，軟骨細(xì)胞在聚集培養(yǎng)的過(guò)程中，分泌的生長(zhǎng)因子在局部積聚，并且細(xì)胞和細(xì)胞基質(zhì)不斷地進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，有利于維持和恢復(fù)細(xì)胞表型。因此，在軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的過(guò)程中，接種密度不應(yīng)過(guò)低。生物反應(yīng)器通過(guò)控制培養(yǎng)環(huán)境的pH、營(yíng)養(yǎng)等，模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的微環(huán)境，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供適宜的條件。軟骨細(xì)胞在生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行三維培養(yǎng)時(shí)可快速擴(kuò)增，從而可獲得表型穩(wěn)定的永生化軟骨細(xì)胞。

2.1.2同種異體軟骨細(xì)胞 關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成，軟骨細(xì)胞存在于細(xì)胞外基質(zhì)形成的軟骨陷窩中，可阻擋免疫細(xì)胞的攻擊，故同種異體軟骨細(xì)胞進(jìn)行移植時(shí)免疫反應(yīng)較輕微。并且，軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過(guò)程中經(jīng)過(guò)酶消化等步驟后，抗原被處理，免疫原性降低。即使嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)也可通過(guò)免疫抑制劑消除。同種異體軟骨細(xì)胞來(lái)源較廣，關(guān)節(jié)軟骨、肋軟骨及耳軟骨等均可作為其來(lái)源。一次消化可獲得充足的軟骨細(xì)胞，可有效解決細(xì)胞來(lái)源不足的問(wèn)題。國(guó)外已有學(xué)者報(bào)道過(guò)同種異體軟骨細(xì)胞移植在修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損方面取得了滿意的療效［9］。但是同種異體軟骨細(xì)胞移植有可能傳播疾病，并且在獲取的過(guò)程中對(duì)供體也造成一定傷害。

2.2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）BMSCs來(lái)源于中胚層，存在于骨髓中，具有高度自我更新和多向分化的能力［10］。BMSCs因來(lái)源廣泛、分化能力強(qiáng)越來(lái)越受到學(xué)者們的重視。Kurod等［11］研究顯示，自體BMSCs移植不存在免疫排斥反應(yīng)，為安全的種子細(xì)胞來(lái)源。分離BMSCs的辦法也比較多，最常用的是密度梯度離心法和貼壁分離法。密度梯度離心法獲得的原代細(xì)胞純度高，但細(xì)胞活性低，貼壁數(shù)量少；貼壁分離法可通過(guò)換液去除雜質(zhì)和不貼壁的細(xì)胞，獲得的細(xì)胞純度較高。BMSCs有向骨、軟骨、脂肪分化的能力，包含血小板衍生生長(zhǎng)因子、β轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等多種細(xì)胞因子均可誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化［12］。為確定獲得的細(xì)胞確實(shí)為BMSCs而非其它成纖維樣細(xì)胞，需使用流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行鑒定。CD44、CD90、CD105是鑒定BMSCs的陽(yáng)性表面標(biāo)志，CD34、CD45為陰性表面標(biāo)志［13］。陽(yáng)性表面標(biāo)志和陰性表面標(biāo)志的百分比與細(xì)胞的純度呈正比。雖然BMSCs的增殖能力和分化能力較強(qiáng)，但其數(shù)量較少，僅占全骨髓的1/105～1/104。BMSCs對(duì)分化成軟骨細(xì)胞所需的誘導(dǎo)條件要求較高，但也有研究表明重度骨性關(guān)節(jié)炎患者BMSCs的成軟骨能力明顯減弱［14］。BMSCs傳代至90代后可發(fā)生癌變，故對(duì)其作為軟骨組織工程的種子細(xì)胞來(lái)源應(yīng)保持警惕。

2.3脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）ADSCs同樣來(lái)自于中胚層，具有多向分化潛能，并且有免疫抑制作用［15］。ADSCs在含地塞米松、維生素、胰島素等組成的成軟骨誘導(dǎo)液分化后，可分化為軟骨細(xì)胞。因CD49在ADSCs中陽(yáng)性表達(dá)，CD106陰性表達(dá)，CD34為低水平表達(dá)，可據(jù)此對(duì)ADSCs進(jìn)行鑒定［16］。ADSCs來(lái)源廣泛，取材方便，對(duì)供體損傷較小，并且細(xì)胞含量豐富，ADSCs的粘附與增殖能力與供者的年齡無(wú)關(guān)，僅與體質(zhì)有關(guān)，是比較理想的種子細(xì)胞來(lái)源［17］。但Winter等［18］研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs與BMSCs相比成軟骨能力要弱。ADSCs在三維培養(yǎng)環(huán)境中高密度培養(yǎng)進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)時(shí)可形成軟骨細(xì)胞，在單層培養(yǎng)環(huán)境中進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)則成軟骨失敗。因此，在ADSCs應(yīng)用于軟骨組織工程方面還需要進(jìn)一步的研究。2.4 胚胎干細(xì)胞 胚胎干細(xì)胞具有分化為三胚層的潛能，在適當(dāng)?shù)臈l件下可分化為所有組織器官類(lèi)型的細(xì)胞。目前已經(jīng)有研究證實(shí)胚胎干細(xì)胞可在支架材料中進(jìn)行生長(zhǎng)、擴(kuò)增和分化［19］。Kramer等［20］研究表明骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4能促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。與軟骨細(xì)胞相比，胚胎干細(xì)胞具有很強(qiáng)的再生能力和分化潛能，能很好地完成細(xì)胞的更新，這是其作為軟骨組織工程種子細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)。但是目前胚胎干細(xì)胞用于臨床治療尚存在倫理學(xué)問(wèn)題，本身具有致瘤性和免疫原性，并且體外培養(yǎng)條件要求嚴(yán)格，這就限制了胚胎干細(xì)胞在軟骨組織工程中的進(jìn)一步應(yīng)用。

2.5臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）臍帶連于胚胎臍部與胎盤(pán)間，從中可分離出UCMSCs，并且成功率很高［21］。UCMSCs在體外培養(yǎng)時(shí)貼壁生長(zhǎng)，具有成纖維細(xì)胞的形態(tài)。UCMSCs除表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志外，還表達(dá)胚胎轉(zhuǎn)錄因子Nanog等更原始的表面分子［22］。酶消化法和組織塊培養(yǎng)法是目前消化分離UCMSCs的主要方法，酶消化法的缺點(diǎn)在于有可能損傷細(xì)胞并破壞細(xì)胞表面標(biāo)志［23］。組織塊培養(yǎng)法雖簡(jiǎn)單可控，但培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，組織塊貼壁不牢固并且容易污染。Deans等［24］研究發(fā)現(xiàn)UCMSCs可不被同種異體T細(xì)胞識(shí)別和排斥，不會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液對(duì)UCMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)后，細(xì)胞會(huì)分泌較多的的Ⅱ型膠原。另外，臍帶中富含透明質(zhì)酸、糖胺聚糖以及膠原，是透明軟骨的重要細(xì)胞外基質(zhì)，與天然軟骨的細(xì)胞外成分極為相似。并且，臍帶屬于廢棄物，來(lái)源較為廣泛，價(jià)格低廉，不存在倫理問(wèn)題。因此，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞很有可能會(huì)成為未來(lái)軟骨組織工程研究的重點(diǎn)。

2.6滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞（synovium-derived mesenchymal stem cells，SMSCs）自從2001年成功分離出SMSCs以來(lái)，學(xué)者們對(duì)它的研究就從未停止過(guò)。SMSCs來(lái)源于關(guān)節(jié)囊的內(nèi)層（滑膜層），屬于間葉細(xì)胞。酶消化法和組織塊接種法均可成功分離SMSCs。SMSCs在體外培養(yǎng)時(shí)既有圓形的巨噬樣細(xì)胞，也有紡錘形的成纖維樣細(xì)胞。培養(yǎng)初期兩種細(xì)胞混合存在，但成纖維樣細(xì)胞增殖的速度要比巨噬樣細(xì)胞快得多，當(dāng)細(xì)胞融合至90％以后，視野中幾乎全為成纖維樣細(xì)胞?；らg充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞高［25］。流式細(xì)胞儀檢測(cè)SMSCs表達(dá)CD44、CD90，不表達(dá)CD34、CD45［26，27］。SMSCs不表達(dá)Ⅱ類(lèi)組織相容性抗原RLADQ，其免疫原性較低，不會(huì)或很少發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。因此SMSCs可用于同種異體移植，為組織工程的研究帶來(lái)了一線生機(jī)［28］。并且SMSCs是正常的二倍體細(xì)胞，無(wú)致瘤性，安全可靠，與BMSCs基因譜相比，SMSCs基因譜與軟骨細(xì)胞基因譜更為接近［29］。Dry等［30］進(jìn)行的一項(xiàng)研究表明Ca2+可促進(jìn)SMSCs增殖，高峰出現(xiàn)在Ca2+濃度為5.0 mmol/L時(shí)，可以通過(guò)適當(dāng)補(bǔ)充Ca2+以加速SMSCs增殖；而與胎牛血清相比，人血清也能加速SMSCs增殖。

2.7基因修飾后的細(xì)胞 基因修飾可通過(guò)轉(zhuǎn)染等技術(shù)將目的基因?qū)氚屑?xì)胞，使其表達(dá)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等達(dá)到修復(fù)組織缺損的目的。該技術(shù)在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中應(yīng)用的最為廣泛。軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染后生存率較高，毒性小，長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中分化成軟骨的能力沒(méi)有變化。

將BMP-2和BMP-4轉(zhuǎn)入胚胎干細(xì)胞內(nèi)以后，胚胎干細(xì)胞可向軟骨細(xì)胞分化。并且，基因修飾后的軟骨細(xì)胞有很強(qiáng)的生物學(xué)功能，可很好地解決自體軟骨細(xì)胞供量不足的問(wèn)題，縮短體外培養(yǎng)時(shí)間，維持軟骨細(xì)胞的表型。包括腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、脂質(zhì)體在內(nèi)的多種載體均可成功轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞。但是，Seo等［31］發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染的目的基因可以破壞宿主本身的基因結(jié)構(gòu)，而且目的基因表達(dá)的生長(zhǎng)因子長(zhǎng)期過(guò)多表達(dá)會(huì)對(duì)靶細(xì)胞帶來(lái)改變。不僅如此，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分泌的糖胺聚糖和Ⅱ型膠原的量會(huì)減少，這就限制了該技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用。故該技術(shù)的安全性和可靠性仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

自“組織工程”的概念提出以來(lái)，學(xué)者們一直在尋找合適的細(xì)胞作為種子細(xì)胞。隨著學(xué)者們研究的不斷深入，軟骨細(xì)胞、BMSCs、ADSCs等種子細(xì)胞逐漸應(yīng)用于組織工程中。然而，每一類(lèi)種子細(xì)胞都有其自身的優(yōu)缺點(diǎn)。因此，還需要后續(xù)的進(jìn)一步研究來(lái)探討各類(lèi)種子細(xì)胞的特點(diǎn)，并積極尋找新型種子細(xì)胞以擴(kuò)充組織工程的種子細(xì)胞庫(kù)。種子細(xì)胞篩選、培養(yǎng)和組織構(gòu)建的規(guī)范化及安全性評(píng)價(jià)將是今后的研究方向，當(dāng)組織工程真正應(yīng)用于臨床，將能解決較多難題。

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（2016-03-01 收稿2016-05-26 修回）

（責(zé)任編輯潘奕婷）

Research progress on the source of seed cells in cartilage tissue engineering

CONG Bo and ZHANG Zhongwen. The Fourth Department of Orthopedics，General Hospital of Chinese People's Armed Police Forces，Beijing 100039，China Corresponding author：ZHANG Zhongwen，E- mail：zhang6816151@163.com

【Abstract】The morbidity of articular cartilage defects is high.Consequently，life qualities of patients with articular cartilage defects are severely affected；effects of traditional treatment are not good.Tissue engineering techniques has been applied to preliminary clinical practice which showed a promising approach for reparation of cartilage defect.This review focuses on the research development regarding seed cells of cartilage tissue engineering.

【Key words】cartilage；tissue engineering；seed cells

【中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào)】R318

DOI：10.13919/j.issn.2095-6274.2016.06.011

基金項(xiàng)目：“首都臨床特色應(yīng)用研究”項(xiàng)目（Z161100000516013）； 武警總醫(yī)院一類(lèi)課題（WZ2012016）

作者簡(jiǎn)介：叢 波，碩士研究生在讀，E-mail：635254548@qq.com

作者單位：100039 北京，武警總醫(yī)院骨四科

通訊作者：張仲文，E-mail：zhang6816151@163.com